本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種變體aav衣殼蛋白、重組腺相關(guān)病毒raav及其用途。

背景技術(shù)：

1、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括帕金森病、阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦膜瘤等腦腫瘤疾病，這些疾病在老年人中尤為普遍，通常是由遺傳性基因突變引起的，這些突變導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常、神經(jīng)變性或神經(jīng)元功能受損等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病給家庭和社會帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)和影響。針對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療或是需要通過全腦性基因修復(fù)或功能蛋白補(bǔ)償?shù)龋浯竽X本身的血腦屏障，即血腦屏障是指腦毛細(xì)血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞形成的血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，在阻止有害物質(zhì)進(jìn)入大腦的同時也是阻礙藥物進(jìn)入中樞神經(jīng)的主要障礙，如何突破血腦屏障高效特異遞送藥物，是目前神經(jīng)系統(tǒng)治療和神經(jīng)科學(xué)研究的主要難題。

2、遞送目的藥物至神經(jīng)系統(tǒng)，需要工具載體，在眾多現(xiàn)有的工具載體中，aav載體因其出色的遞送效率、穩(wěn)定的安全性和相對較低的細(xì)胞毒性等特性而廣受歡迎。aav血清型眾多，不同血清型有不同的靶向感染特性，9型aav(aav9)是研究最為廣泛的一種，在aav9基礎(chǔ)上進(jìn)行衣殼蛋白改造獲得一系列能高效跨血腦屏障的aav變體，但大多數(shù)都有較強(qiáng)地肝臟嗜性，這種脫靶遞送可能引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)或者引起肝毒性。此外，研究報道其他血清型aav也能跨血腦屏障，如aavhu.32(yoon?et.al.,2020,143；2058-2072)，但是aavhu.32跨血腦屏障效率不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種變體aav衣殼蛋白、重組腺相關(guān)病毒raav及其用途，所述重組腺相關(guān)病毒raav可以更高效特異地跨血腦屏障進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛性藥物遞送，且具有低肝臟嗜性，可以為神經(jīng)科學(xué)研究和腦疾病治療提供了更好的工具，具有廣闊的應(yīng)用價值和市場前景。

2、為此，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了一種變體aav衣殼蛋白，包括：

4、1)、與seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有至少80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、98％以上的同一性的氨基酸序列；以及

5、2)、如seq?id?no.1所示的氨基酸序列包括：在第449位～458位的氨基酸序列ktingsgqnq突變成rtidgaatkn，以及在第587位～588位的氨基酸aq替換為氨基酸序列dgtlavpfk。

6、上述變體aav衣殼蛋白是在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上經(jīng)過在第449位～458位的氨基酸序列ktingsgqnq突變成rtidgaatkn，以及在第587位～588位的氨基酸aq替換為氨基酸序列dgtlavpfk。

7、在一些實(shí)施方式中，上述變體aav衣殼蛋白還可以進(jìn)行至少一個氨基酸的缺失、取代和/或插入，獲得的變體aav衣殼蛋白可以與天然aav衣殼蛋白可以具有80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、98％以上的同一性的氨基酸序列。比如第449位～458位的氨基酸序列ktingsgqnq突變成etidgaatkn、raidgaatkn、rtmdgaatkn、rtipgaatkn、rtidkaatkn、rtidgqatkn、rtidgavtkn、rtidgaaikn、rtidgaattn、rtidgaatkg、rtiggamtkn、stidgaatfn、rqidgaamkn、rtidraytkn、ritdgaatkn、rmidggptkn、ttilgaatet、dtiggaitqn等，經(jīng)本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，由上述aav衣殼蛋白的血清型質(zhì)粒制備的重組腺相關(guān)病毒，與raavhu.32-dm的血清型質(zhì)粒制備的重組腺相關(guān)病毒相比，raavhu.32-dm的重組腺相關(guān)病毒在全腦區(qū)域表現(xiàn)出更強(qiáng)的熒光及更多的陽性細(xì)胞數(shù)，在肝臟中raavhu.32-dm介導(dǎo)的熒光表達(dá)強(qiáng)度更低，脫靶感染更低。故作為最佳的實(shí)施方式，為上述的變體aav衣殼蛋白是在seq?id?no.1所示的氨基酸序列上經(jīng)過在第449位～458位的氨基酸序列ktingsgqnq突變成rtidgaatkn，以及在第587位～588位的氨基酸aq替換為氨基酸序列dgtlavpfk，該變體aav衣殼蛋白構(gòu)建的重組腺相關(guān)病毒載體，可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)基因遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時具有顯著降低的肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，其能用于更高效跨血腦屏障轉(zhuǎn)導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，可以為神經(jīng)科學(xué)研究和全腦系統(tǒng)性遺傳疾病、神經(jīng)退行性疾病等治療提供了更好的工具，具有廣闊的應(yīng)用價值和市場前景。

8、在一些實(shí)施方式中，所述aav衣殼蛋白存在于所述aav衣殼的vp1、vp2和/或vp3中。作為最佳的實(shí)施方式，所述aav衣殼蛋白存在于所述aav衣殼的vp1中。

9、在一些實(shí)施方式中，所述aav衣殼蛋白是嵌合的。

10、在一些實(shí)施方式中，當(dāng)在全身地遞送給受試者的情況下，在所述受試者的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中測量時，相對于seq?id?no.1所示的天然aavhu.32衣殼蛋白，所述變體aav衣殼蛋白對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織和/或細(xì)胞的特異性增加和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率增加。

11、在一些實(shí)施方式中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞選自如下至少一種細(xì)胞類型：神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和大腦血管細(xì)胞；

12、在一些實(shí)施方式中，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織選自如下至少一種組織類型：大腦、丘腦、皮質(zhì)、紋狀體、腹側(cè)中腦、脊髓和小腦。

13、在一些實(shí)施方式中，當(dāng)在全身地遞送給受試者的情況下，在所述受試者的脫靶組織和/或脫靶細(xì)胞中測量時，相對于seq?id?no.1所示的天然aavhu.32衣殼蛋白，所述變體aav衣殼蛋白對脫靶組織和/或脫靶細(xì)胞的特異性降低和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率降低；

14、可選的，所述的脫靶組織包括肝臟組織；可選的，所述脫靶細(xì)胞包括肝臟細(xì)胞。

15、本發(fā)明提供了一種生物材料，包括如下任意一項(xiàng)：

16、1)、編碼所述的變體aav衣殼蛋白的核酸分子；

17、2)、含有1)中所述核酸分子的重組載體；

18、3)、含有1)中所述核酸分子或(2)中所述重組載體的宿主細(xì)胞。

19、本發(fā)明披露的實(shí)施方式涉及一種重組腺相關(guān)病毒raav，含有所述的變體aav衣殼蛋白；

20、作為最佳的實(shí)施方式，還包括編碼目的產(chǎn)物異源核苷酸序列；

21、作為最佳的實(shí)施方式，所述目的產(chǎn)物包括核酸、肽或蛋白質(zhì)；

22、作為最佳的實(shí)施方式，所述核酸選自sirna或小向?qū)na；

23、作為最佳的實(shí)施方式，所述重組腺相關(guān)病毒raav的原始載體為raavhu.32。

24、作為最佳的實(shí)施方式，所述的變體aav衣殼蛋白存在于所述的重組腺相關(guān)病毒raav衣殼蛋白vp1中。

25、本發(fā)明披露的實(shí)施方式涉及一種藥物組合物，含有所述的重組腺相關(guān)病毒raav以及藥學(xué)上可接受的輔料。

26、術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”表明所指定的載體、介質(zhì)、稀釋劑、賦形劑和/或鹽總體與構(gòu)成所述劑型的其他成分在化學(xué)和/或物理上相容，并且與其接受者在生理上相容。

27、“藥學(xué)上可接受的輔料”是指藥物劑型中除了活性成分之外的其他成分，其對于對象來說具有可接受的生物活性并且無毒性。在本文公開的藥物組合物中使用的可藥用載體可以包括例如可藥用液體、凝膠或固體載體、水性介質(zhì)、非水性介質(zhì)、抗微生物劑、等滲劑、緩沖劑、抗氧化劑、麻醉劑、懸浮/調(diào)配劑、多價螯合或螯合劑、稀釋劑、佐劑、賦形劑或無毒性輔助物質(zhì)、本領(lǐng)域中已知的其他組分或其各種不同組合。

28、本發(fā)明披露的實(shí)施方式涉及所述的重組腺相關(guān)病毒raav在制備用于將目的產(chǎn)物遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的藥物中的用途；

29、作為最佳的實(shí)施方式，所述目的產(chǎn)物包括核酸、肽或蛋白質(zhì)；

30、作為最佳的實(shí)施方式，所述核酸選自sirna或小向?qū)na；

31、作為最佳的實(shí)施方式，包括在制備治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物中的用途；

32、作為最佳的實(shí)施方式，所述中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病包括但不限于神經(jīng)退行性疾病、腦腫瘤疾病、感染性疾病、腦血管疾病以及外部力量導(dǎo)致的創(chuàng)傷性腦損傷中的至少一種；

33、作為最佳的實(shí)施方式，所述神經(jīng)退行性疾病包括但不限于阿爾茨海默病(ad)、帕金森病中風(fēng)、亨廷頓病、肌萎縮側(cè)索硬化癥、多發(fā)性硬化癥中的至少一種；

34、作為最佳的實(shí)施方式，所述腦腫瘤疾病包括但不限于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、腦膜瘤、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、垂體瘤和松果體腫瘤中的至少一種；

35、作為最佳的實(shí)施方式，所述感染性疾病包括但不限于腦或腦膜炎；

36、作為最佳的實(shí)施方式，所述腦血管疾病包括但不限于卒中或蛛網(wǎng)膜下腔出血。

37、本發(fā)明技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

38、1.本發(fā)明提供的一種變體aav衣殼蛋白，包括：1)、與seq?id?no.1所示的氨基酸序列具有至少80％、83％、85％、88％、90％、93％、95％、98％的同一性的氨基酸序列；以及2)、如seq?id?no.1所示的氨基酸序列包括：在第449位～458位的氨基酸序列ktingsgqnq突變成rtidgaatkn，以及在第587位～588位的氨基酸aq替換為氨基酸序列dgtlavpfk；相對于天然aav衣殼蛋白，上述變體aav衣殼蛋白，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組織和/或細(xì)胞的具有高特異性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，能夠用于更高效特異地跨血腦屏障進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛性藥物(包括但不限于基因治療藥物)遞送，同時對肝組織和/或肝細(xì)胞的具有低特異性和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，說明其具有低肝臟嗜性，進(jìn)而采用上述變體aav衣殼蛋白構(gòu)建的相關(guān)產(chǎn)品(包括但不限于重組腺相關(guān)病毒raav或藥物組合物)可以用于跨血腦屏障高效轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)現(xiàn)藥物遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，同時具有顯著降低的肝臟轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。