本發(fā)明屬于分子生物檢測，尤其涉及一種用于檢測昆蟲細胞中多種rna病毒的多重熒光定量pcr檢測組合物、方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

1、昆蟲病毒作為一類以昆蟲為宿主并能使昆蟲致病的病毒，其以昆蟲作為媒介，同時也能夠感染人類及其他哺乳動物，引發(fā)疫病，嚴重可導致死亡。昆蟲細胞被廣泛應(yīng)用于在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中，包括high?five細胞、sf9細胞、d.mel-2細胞在內(nèi)的昆蟲細胞常被用于病毒疫苗、重組蛋白以及病毒載體的生產(chǎn)中，因此昆蟲細胞中的外源病毒感染被認為是一項主要的安全性問題。

2、常見的能夠感染昆蟲細胞的rna病毒包括彈狀病毒科、諾達病毒科、黃病毒科、布尼亞病毒科等，而比較具有代表性的病毒包括被報道能感染sf細胞系的sf彈狀病毒、能夠感染high?five細胞的獸棚病毒變異株、包括牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒、乙腦病毒在內(nèi)的哺乳動物病毒、以及腦心肌炎病毒、松毛蟲ω病毒、白蛉熱病毒等。

3、目前傳統(tǒng)的昆蟲病毒檢測方法一般包括生物學測定法、電子顯微鏡觀察、基于酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)的血清學方法、基于核酸分析的pcr檢測方法等，普遍存在檢測靈敏度低、特異性差等情況，同時傳統(tǒng)的qpcr方法多采用單獨的檢測試劑盒，操作繁瑣、耗時長、容易出現(xiàn)假陽性或無法覆蓋較全的病毒種類，不同病毒檢測反應(yīng)體系及程序相差較大，無法滿足多種病毒同時檢測的需求。同時常見的rna病毒檢測方法在rna抽提、反轉(zhuǎn)等過程中沒有較好的質(zhì)控品，傳統(tǒng)的qpcr選擇的標準品多為質(zhì)粒，并能不夠比較真實的反應(yīng)rna病毒的狀態(tài)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種用于檢測昆蟲細胞中多種rna病毒的多重熒光定量pcr檢測組合物、方法及試劑盒，可以準確、快速的檢測樣品中的昆蟲病毒。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本技術(shù)采用了如下技術(shù)方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測昆蟲細胞中多種rna病毒的多重熒光定量pcr檢測組合物，所述檢測組合物包括檢測如下rna病毒的引物和探針：

4、檢測sf彈狀病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：1所示，下游引物如seq?idno：2所示，探針如seq?id?no：3所示；

5、檢測獸棚病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：4所示，下游引物如seq?idno：5所示，探針如seq?id?no：6所示；

6、檢測牛病毒性腹瀉病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：7所示，下游引物如seq?id?no：8所示，探針如seq?id?no：9所示；

7、檢測豬瘟病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：10所示，下游引物如seq?idno：11所示，探針如seq?id?no：12所示；

8、檢測乙腦病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：13所示，下游引物如seq?idno：14所示，探針如seq?id?no：15所示；

9、檢測果蠅x病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：16所示，下游引物如seq?idno：17所示，探針如seq?id?no：18所示；

10、檢測腦心肌炎病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：19所示，下游引物如seqid?no：20所示，探針如seq?id?no：21所示；

11、檢測松毛蟲ω病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：22所示，下游引物如seqid?no：23所示，探針如seq?id?no：24所示；

12、檢測白蛉熱病毒的引物和探針：上游引物如seq?id?no：25所示，下游引物如seqid?no：26所示，探針如seq?id?no：27所示。

13、第二方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測昆蟲細胞中多種rna病毒的多重熒光定量pcr檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含上述檢測組合物。

14、探針的熒光基團為fam、vic或cy5，淬滅基團選擇bhq1或bhq2。

15、在以上技術(shù)方案中，所述檢測試劑盒包含陽性對照品、陰性對照品以及熒光定量pcr反應(yīng)試劑。

16、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)試劑為熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液，包括2×one?step?rt-pcr?bufferⅲ、ex?taq?hs、rt?enzyme?mixⅱ、rox?reference?dye內(nèi)參染料、無核酶水、以及上述檢測組合物。

17、在以上技術(shù)方案中，所述陽性對照品包含陽性rna標準品，濃度均為2×108copies/μl。

18、在以上技術(shù)方案中，所述檢測試劑盒中的熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測樣品的rna、陽性對照標準品和陰性對照標準品。

19、在以上技術(shù)方案中，所述反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：42℃反轉(zhuǎn)5min；95℃預(yù)變性3min；95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環(huán)。

20、第三方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測昆蟲細胞中多種rna病毒的多重熒光定量pcr檢測方法，所述檢測方法非診斷或治療目的，包括如下步驟：

21、(1)提取待測樣品的rna模板；

22、(2)采用上述檢測組合物建立熒光定量pcr反應(yīng)體系；

23、(3)進行熒光定量pcr檢測；

24、(4)待測樣品的結(jié)果分析。

25、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系為20μl，包含15μl的熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液和5μl的模板；所述模板為待測樣品的rna、陽性對照標準品和陰性對照標準品；所述熒光定量pcr反應(yīng)預(yù)混液包括2×one?step?rt-pcr?bufferⅲ、ex?taq?hs、rt?enzymemixⅱ、rox?reference?dye內(nèi)參染料、無核酶水、以及上述檢測組合物。

26、在以上技術(shù)方案中，所述熒光定量pcr反應(yīng)體系的反應(yīng)條件為：42℃反轉(zhuǎn)5min；95℃預(yù)變性3min；95℃變性5s，60℃退火34s，40個循環(huán)。

27、本發(fā)明的有益效果在于：

28、1、本發(fā)明旨在檢測能夠感染昆蟲細胞的多種rna病毒，通過數(shù)據(jù)庫分析比對分析，尋找病毒基因組保守序列，設(shè)計具有較強特異性的引物探針，可檢出該病毒的絕大部分亞型。

29、2、本發(fā)明所述檢測組合物，其中探針熒光報告基團可選擇fam、vic或cy5，熒光淬滅基團選擇bhq1或bhq2，即可滿足檢測上述任意一種的rna病毒，同時可檢測任意組合的rna病毒。

30、3、通過對病毒保守區(qū)域設(shè)計多對探針引物，最終篩選特異性好、靈敏度高的引物探針，可準確定量2×107copies/μl至20copies/μl的病毒含量，大部分病毒檢測靈敏度能達到10copies/μl，部分病毒最低靈敏度可達2copies/μl。

31、4、本發(fā)明所述檢測昆蟲細胞中多種rna病毒的檢測試劑盒，含有用于檢測的陽性rna標準品，能夠更真實的反應(yīng)rna病毒檢測過程，同時對rna的qpcr檢測方法進行測試，能夠滿足在一個程序里同時檢測多種rna病毒。

32、5、本發(fā)明通過反復(fù)篩選優(yōu)化反應(yīng)體系，包括引物和探針的濃度，最終該檢測方法可在較少核酸樣本下，能夠穩(wěn)定檢出多種rna病毒，操作簡單，且具有較高的靈敏度。