本發(fā)明屬于基因檢測領域，具體涉及一種檢測bcr::abl1酪氨酸激酶區(qū)復合突變的體系、試劑盒及方法。

背景技術：

1、慢性髓性白血病(chronic?myelogenous?leukemia，cml)是骨髓造血干細胞克隆性增殖形成的惡性腫瘤，占成人白血病的15％，全球年發(fā)病率為1.6/10萬-2/10萬。

2、cml及部分急性淋巴細胞白血病(acute?lymphoblastic?leukemia，all)具有標志性的細胞遺傳學異?！猼(9；22)(q34；q11)形成的ph染色體，分子水平形成bcr::abl1融合基因，導致abl1酪氨酸激酶處于持續(xù)活化狀態(tài)。伊馬替尼等酪氨酸激酶抑制劑(tki)已成為cml一線治療及ph+all治療方案的重要組成，大部分患者能夠獲得滿意療效，但是仍有部分患者發(fā)生原發(fā)或繼發(fā)耐藥。

3、研究結果顯示，伊馬替尼、尼洛替尼和達沙替尼耐藥的cml患者，半數(shù)以上均檢測出bcr::abl1激酶區(qū)突變，其中t315i突變比例均為最高，部分患者檢出復合突變(cms)。復合突變指同一個bcr::abl1分子上同時存在2種突變，目前現(xiàn)有的單藥tki包括普納替尼和阿西米尼均不敏感，是耐藥領域中的棘手問題。cms通常由于患者對多種tki連續(xù)耐藥，在原有的突變克隆未被完全消除的情況下，遭受序貫tki耐藥的“二次打擊”從而產(chǎn)生。不同的突變對應的tki耐藥不同，突變檢測可幫助了解突變狀態(tài)以優(yōu)化治療，指導患者精準用藥。

4、abl1突變是目前唯一可用于指導臨床治療決策的。無論是eln還是nccn指南，當cml患者出現(xiàn)非最佳療效或治療失敗時，均建議完善abl1突變檢測，以指導患者及時更換合適、敏感的tki藥物，從而改善治療反應和結局、防止出現(xiàn)包括復合突變在內的突變累積，導致疾病進展。

5、《bcr::abl1酪氨酸激酶區(qū)突變檢測實驗室規(guī)范中國專家共識》中指出直接測序法是當前臨床工作中abl1突變檢測的常規(guī)方法，其結果是指導臨床治療的主要指標。然而直接測序法(sanger測序)的敏感度只有10％～20％，無法充分滿足當前臨床要求。質譜(ms)的突變特異性更靈敏且準確(1％到5％)，但是質譜法不能檢測新發(fā)突變，也難以識別由雙核苷酸替換引發(fā)的突變，如t315i和t315m突變。低比例突變、復合突變以及突變的克隆演變等問題一直困擾著突變的精準評估。

6、因此，利用更加靈敏有效的檢測手段早期地進行bcr::abl1突變位點的篩查，特別是低比例突變、復合突變以及突變的克隆演變的篩查，盡早地發(fā)現(xiàn)病情變化，及時地采取措施干預或者更換治療方案對患者的預后至關重要。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供一種檢測bcr::abl1酪氨酸激酶區(qū)復合突變的體系、試劑盒及方法，本發(fā)明檢測方法利用高通道測序技術，不僅檢測靈敏高，而且突變檢出比例明顯高于sanger法測序結果，能夠獲得bcr::abl1詳細突變狀態(tài)，為患者預后治療提供重要的信息。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：

3、本發(fā)明提供了一種擴增bcr::abl1融合基因轉錄本的體系，該體系包括一步法擴增試劑，所述一步法擴增試劑包括：pcr緩沖液、一步法引物混合物、反轉錄酶、dna聚合酶、基因組dna去除酶、rna酶抑制劑和無核酸酶水；

4、所述一步法引物混合物包括引物bcr-out1f、bcr-out2f和abl1-outr，所述引物的核苷酸序列如seq?id?no.1-3所示。

5、優(yōu)選地，所述pcr緩沖液包括：tris-hcl、kcl、mgcl2、dtt、dntp、oligo?d(t)23vn、隨機引物、增強劑；所述增強劑選自甜菜堿、np-40、tween20、triton-x100中的一種或多種的組合。

6、優(yōu)選地，所述反轉錄酶選自amv?reverse?transcriptase、m-mulv?reversetranscriptase、superscript?ii?reverse?transcriptase、superscript?iii?reversetranscriptase、superscript?iv?reverse?transcriptase、maxima?h?minus?reversetranscriptase中的一種或幾種的組合。

7、優(yōu)選地，所述dna聚合酶為taq酶或lataq酶。

8、優(yōu)選地，所述基因組dna去除酶選自dnase?i、exonuclease?iii、exonuclease?t7、exonuclease?viii、dsdnase中的一種或幾種的組合。

9、優(yōu)選地，所述rna酶抑制劑選自sds、尿素、硅藻土、異硫氰酸胍和rnasin中的一種或幾種的組合。

10、本發(fā)明還提供了一種檢測bcr::abl1融合基因酪氨酸激酶區(qū)復合突變的體系，所述體系包括上述擴增體系，還包括激酶區(qū)擴增試劑和文庫擴增試劑；所述激酶區(qū)擴增試劑包括：2xpcr?mix、擴增子引物混合物和無核酸酶水；所述文庫擴增試劑試劑包括：2xpcrmix和文庫擴增引物混合物；

11、所述擴增子引物混合物包括引物abl1f，abl1r，abl2f，abl2r，abl3f，abl3r，abl4f和abl4r，其核苷酸序列表如seq?id?no.4-11所示；所述核苷酸序列表中n代表隨機堿基，所述隨機堿基有12位；

12、所述文庫擴增引物混合物包括引物sj50x和引物sj70x，所述引物sj50x的核苷酸序列如seq?id?no.12所示，其核苷酸序列的第30位到37位為dna堿基的index序列；所述引物sj70x的核苷酸序列如seq?id?no.13所示，其核苷酸序列的第25位到32位為dna堿基的index序列。

13、本發(fā)明還提供了一種檢測bcr::abl1融合基因酪氨酸激酶區(qū)復合突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括上述檢測bcr::abl1融合基因轉錄本雙鏈cdna的體系。

14、本發(fā)明還提供了一種檢測bcr::abl1酪氨酸激酶區(qū)復合突變的方法，包括以下步驟：

15、s1.提取rna核酸，定量后與上述一步法擴增試劑反應，并對擴增產(chǎn)物進行純化；

16、s2.將步驟s1中純化后的產(chǎn)物與上述激酶區(qū)擴增試劑反應，并對反應產(chǎn)物進行分選；

17、s3.將步驟s2中分選后的產(chǎn)物與上述文庫擴增試劑反應，并對反應產(chǎn)物再次進行純化，得到最終文庫；

18、s4.將步驟s3中純化后得到的最終文庫進行高通量測序、序列對比和突變分析，最終得到bcr::abl1酪氨酸激酶區(qū)復合突變的結果。

19、優(yōu)選地，所述步驟s1中與一步法擴增試劑反應時所用rna進入量為500-3000ng，優(yōu)選為1000-3000ng。

20、優(yōu)選地，所述步驟s1中還包括與一步法擴增試劑反應后的pcr反應，所述pcr反應程序為50℃，30min；95℃5min；95℃20sec，60℃20sec，68℃2min，循環(huán)30個；68℃5min。

21、本發(fā)明還提供了上述體系或試劑盒或檢測方法，在檢測白血病患者對酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性中的應用。

22、本發(fā)明的有益效果：

23、1、本發(fā)明采用的反應體系能夠一步法得到m型和m型融合基因轉錄本雙鏈cdna，擴增子引物不含有二聚體、發(fā)卡結構和錯配，且引物中引入隨機堿基標簽，極大地提高了低頻的檢測靈敏度，也降低了假陽性變異檢出的概率。

24、2、本發(fā)明激酶區(qū)檢測范圍覆蓋abl1基因(genebanknm_005157.6)的v225-r516位點區(qū)域，覆蓋度好，平均測序深度達到27萬。

25、3、本發(fā)明使用自建高通量測序法檢測abl1激酶區(qū)突變，可以檢出低頻突變，檢測靈敏度可達1％，可以靈敏地檢出≥2個突變的復合突變。