本發(fā)明屬于小麥抗病育種和分子生物學(xué)，尤其涉及一種用于檢測(cè)小麥抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)qfcr.hebau-4as的dcaps分子標(biāo)記及應(yīng)用，具體涉及360份國(guó)內(nèi)外普通小麥種質(zhì)資源莖基腐病抗性緊密連鎖snp位點(diǎn)的篩選和鑒定以及其dcaps分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、普通小麥(triticum?aestivum)是全球范圍內(nèi)重要的糧食作物，其抗病穩(wěn)產(chǎn)對(duì)世界糧食安全和農(nóng)業(yè)發(fā)展具有重要意義。隨著小麥-玉米大規(guī)模輪作、秸稈還田，以及土壤微環(huán)境的變化，小麥莖基腐病危害呈逐年加重趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅小麥產(chǎn)量和品質(zhì)。小麥莖基腐病(fusariumcrownrot，fcr)是一種由鐮孢菌屬真菌(fusarium?spp.)引起的發(fā)生在世界上許多干旱和半干旱種植區(qū)的土傳病害，于1951年在澳大利亞首次被發(fā)現(xiàn)(magee?c，commonwealth?phytopathological?news，1957)。在澳大利亞、加拿大、中國(guó)、新西蘭、北非、南非和美國(guó)等國(guó)家均有發(fā)生(kazan?k等，molecularplant?pathology，2018；kumar?j等，molecular?plant?pathology，2002)。培育抗病品種，依舊是減輕莖基腐病危害最為經(jīng)濟(jì)環(huán)保的手段。然而，受較為復(fù)雜的數(shù)量遺傳位點(diǎn)(qtl)控制，小麥抗莖基腐病遺傳學(xué)研究仍相對(duì)滯后，抗病種質(zhì)資源同樣亟待挖掘。隨后我國(guó)開始進(jìn)行小麥抗莖基腐病種質(zhì)資源篩選和抗病基因篩選，目前我組已對(duì)小麥抗莖基腐病遺傳學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行了系統(tǒng)梳理，已報(bào)道的小麥莖基腐病抗性位點(diǎn)/基因約有92個(gè)，分布于19條染色體(蘇君等，frontiers?ingenetics，2021)。

2、分子標(biāo)記通常指dna分子標(biāo)記，指?jìng)€(gè)體或物種之間dna序列的差異，與表達(dá)某種性狀的目標(biāo)基因接近或緊密連鎖，且不影響目的基因的表達(dá)。根據(jù)檢測(cè)方法以及發(fā)展歷史，dna分子標(biāo)記分為三類：第一代分子標(biāo)記技術(shù)以分子雜交技術(shù)為核心，如限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)；第二代分子標(biāo)記技術(shù)以pcr技術(shù)為核心，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性dna標(biāo)記(rapd)和簡(jiǎn)單重復(fù)序列(ssr)；第三代分子標(biāo)記技術(shù)以dna序列為核心，如單核苷酸多態(tài)性(snp)(amiteye等人，2021)。隨著二代測(cè)序和三代測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，關(guān)于ssr和snp分子標(biāo)記的研究在植物研究中逐漸占據(jù)了主要地位。分子標(biāo)記輔助選擇育種是分子標(biāo)記最重要的用途之一，基于分子標(biāo)記的基因型對(duì)表型進(jìn)行選擇，能夠克服傳統(tǒng)育種耗時(shí)耗力的缺點(diǎn)。

3、檢測(cè)snp的簡(jiǎn)便方法是酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(caps)標(biāo)記或衍生caps標(biāo)記(dcaps)。這兩種方法都是將pcr擴(kuò)增與酶切反應(yīng)相結(jié)合，利用限制性內(nèi)切酶識(shí)別目標(biāo)snp位點(diǎn)序列并進(jìn)行酶切，再通過(guò)電泳分型鑒定。對(duì)于天然存在酶切位點(diǎn)的snp序列可以開發(fā)caps標(biāo)記，而對(duì)于非天然存在酶切位點(diǎn)的snp則可人為引入突變堿基后開發(fā)dcaps。caps和dcaps分子標(biāo)記具有共顯性、位點(diǎn)特異性、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速、成本低廉且不依賴于精密儀器設(shè)備等特點(diǎn)，可用于快速對(duì)植物進(jìn)行基因分型、定位、遺傳多樣性分析、品種鑒定等方面。

4、當(dāng)前對(duì)與小麥莖基腐病抗性相關(guān)dcaps分子標(biāo)記的研究和報(bào)道較少，因此開發(fā)與小麥莖基腐病相關(guān)dcaps分子標(biāo)記，并將其用于鑒定小麥及其雜交后代的莖基腐病抗性的精準(zhǔn)快速鑒定存在日益增加的需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種用于鑒定小麥抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)的分子標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明借助于已具備15k?snp芯片數(shù)據(jù)的國(guó)內(nèi)外360份小麥材料，結(jié)合中國(guó)春參考序列，開發(fā)了與小麥抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)緊密連鎖的分子標(biāo)記4as-ax-111108057。利用該分子標(biāo)記可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)不同小麥，實(shí)現(xiàn)抗莖基腐病種質(zhì)材料的早期分子輔助選擇，提高小麥抗病育種效率。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中小麥抗莖基腐病基因檢測(cè)難度大的問(wèn)題，適用于分子遺傳育種領(lǐng)域。

2、為達(dá)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明目的之一是提供一種用于檢測(cè)小麥抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)qfcr.hebau-4as的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列dcaps分子標(biāo)記，所述dcaps分子標(biāo)記核苷酸序列如seq?id?no.1或seq?id?no.2所示，用于開發(fā)它的snp位點(diǎn)為小麥4a染色體上的第349299114位，多態(tài)性為g/a。

4、seq?id?no.1：

5、agcttttgaagtgaaggttgcattcggtgaatggatagctgaggaggtcac

6、seq?id?no.2：

7、agcttttgaagtgaaggttgcattcagtgaatggatagctgaggaggtcac

8、本發(fā)明目的之二是提供一種用于檢測(cè)所述dcaps分子標(biāo)記的特異性引物對(duì)，所述特異性引物序列如seq?id?no.3～seq?id?no.4所示。

9、正向引物：agcttttgaagtgaaggttgcactc(seq?id?no.3)

10、反向引物：ttaacatagacatccgaggagaccg(seq?id?no.4)

11、本發(fā)明目的之三是提供一種用于檢測(cè)小麥抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)qfcr.hebau-4as的合成引物試劑盒，其中含有所述特異性引物對(duì)。

12、優(yōu)選的，所述合成引物試劑盒中還含有限制性內(nèi)切酶bsemii。

13、本發(fā)明目的之四是提供一種用于篩選和/或鑒定含有或不含小麥抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)qfcr.hebau-4as株系的方法，所述方法基于所述dcaps分子標(biāo)記，具體包括以下步驟：

14、(1)提取待測(cè)小麥基因組dna；

15、(2)以待測(cè)小麥基因組dna為模板，利用seq?id?no.3和seq?id?no.4所示的特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增反應(yīng)；

16、(3)將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶bsemii進(jìn)行酶切，對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；

17、(4)若酶切產(chǎn)物包含218bp和25bp兩條主帶，且在0-100bp范圍內(nèi)都有一片成片狀的條帶，則該小麥不含抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)qfcr.hebau-4as；若酶切產(chǎn)物只包含243bp一條主帶，則該小麥含有抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)qfcr.hebau-4as。

18、優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系為：濃度100ng/μl的基因組模板1μl，od＝0.1的上游引物1μl、od＝0.1的下游引物1μl，2×rapidtaq?master?mix?7.5μl以及ddh2o?4.5μl。

19、更優(yōu)選地，所述方法中，瓊脂糖凝膠電泳中點(diǎn)樣體積為5μl，電泳條件為65v，110ma，50min。

20、優(yōu)選地，所述pcr擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性5min，循環(huán)參數(shù)為94℃變性30s，63.8℃退火30s，72℃延伸15s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃充分延伸10min。

21、更優(yōu)選地，所述方法中，瓊脂糖凝膠電泳中點(diǎn)樣體積為5μl，電泳條件為65v，110ma，50min。

22、上述pcr擴(kuò)增效率高，電泳結(jié)果雜帶少，體系較為優(yōu)化。

23、本發(fā)明目的之五是提供一種所述dcaps分子標(biāo)記、所述snp位點(diǎn)、所述特異性引物對(duì)、所述合成引物試劑盒或所述方法在小麥育種中的應(yīng)用。

24、本發(fā)明目的之六是提供一種所述dcaps分子標(biāo)記、所述snp位點(diǎn)、所述特異性引物對(duì)、所述合成引物試劑盒或所述方法在檢測(cè)、篩選和/或鑒定含有或不含小麥抗莖基腐病遺傳位點(diǎn)qfcr.hebau-4as中的應(yīng)用。

25、本發(fā)明目的之七是提供一種所述dcaps分子標(biāo)記、所述snp位點(diǎn)、所述特異性引物對(duì)、所述合成引物試劑盒或所述方法在小麥抗莖基腐病分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。

26、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

27、利用本發(fā)明中的dcaps分子標(biāo)記能夠快速、準(zhǔn)確檢測(cè)小麥抗莖基腐病株系(時(shí)間短，可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)獲得結(jié)果)，大大提高檢測(cè)準(zhǔn)確率和縮短檢測(cè)時(shí)間，能夠加快小麥抗莖基腐病的抗病育種進(jìn)程。