本發(fā)明涉及動物病毒檢測，尤其涉及一種用于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組測序的引物組合物、方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus，prrsv)屬于動脈炎病毒科，是一種正鏈的rna病毒，該病毒同時出現(xiàn)在北美和歐洲，并對包括中國在內(nèi)的世界范圍內(nèi)的養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟影響。prrsv可分為兩個基因型，即美洲型和歐洲型，均可引起母豬的流產(chǎn)、死產(chǎn)和豬的呼吸系統(tǒng)疾病等，在中國主要以美洲型為主。prrsv美洲型為9個lineage(1-9)，每個lineage還可細(xì)分為若干sublineage。2006年我國江西省出現(xiàn)病死率極高的高致病性prrsv(hp-prrsv)(屬于lineage?8)，并且短時間內(nèi)在多省份流行，一度給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了毀滅性的打擊。2012年，周峰等在我國分離到了與nadc30同源性極高且在nsp2區(qū)域具有相同缺失模式的毒株，我國學(xué)者將具有此類缺失特征的毒株稱為類nadc30(nadc30-like)毒株(屬于lineage?1，sublineage?1.8)。2017年我國遼寧省首次檢測到nadc34類毒株的存在，由于與美國的ia/2014/nadc34株較為相似在nsp2區(qū)均存在100個氨基酸連續(xù)缺失，因此稱該類毒株為類nadc34(nadc34-like)毒株(屬于lineage?1，sublineage?1.5)。有數(shù)據(jù)顯示，近年來我國類nadc34檢出率持續(xù)增加，從2017～2019年的陽性檢出率不到3％，到2020年上升至11.5％，2021年就高達(dá)28.6％，2022年仍維持較高的檢出率，現(xiàn)階段與類nadc30毒株(35.4％)和hp-prrsv(31.2％)共同成為我國的主要流行毒株。有報道稱，自2020年10月以來，prrsv?1-4-4lineage1c新型變異株在美國多地暴發(fā)，該毒株的傳播能力和致病性較以往美國毒株更強。目前已有多個美國prrsv毒株傳入我國并在國內(nèi)大范圍流行的先例。prrsv毒株基因組極易發(fā)生變異且不同亞型prrsv易發(fā)生重組，并衍生出新的變異重組毒株，這些變異株的流行增加了我國prrsv的多樣性?；蛑亟M是prrsv進(jìn)化的重要手段，prrsv毒株不同譜系之間可以發(fā)生重組，并衍生出新的變異重組毒株。如在2017年福建省分離出的fjliuy-2017毒株是來由lineage?1、lineage?3、lineage?5和lineage?8多譜系重組而來。根據(jù)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的數(shù)據(jù)表明，在2014-2018年期間，美國以lineage?1+lineage?5重組為主，中國以lineage?1+lineage?8重組為主，近年來我國lineage?1譜系的重組頻次高于lineage?8譜系。高變異和易重組是美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的顯著的特點，市面上的熒光定量pcr的方案僅對某些特定的基因保守區(qū)域進(jìn)行檢測，存在著部分譜系毒株的漏檢情況?，F(xiàn)階段常用的方法包含常規(guī)的病毒分離和血清檢測，往往耗時較長、實驗繁瑣等，亟需建立起一種快捷，靈敏度高，全面分析且易于操作的方法來實現(xiàn)疾病的早期診斷。

2、目前，全基因測序的主要方法包括：(1)傳統(tǒng)sanger測序法，其優(yōu)點是測序讀長較長、準(zhǔn)確性高，適用于對病毒基因組的精細(xì)分析和驗證；缺點是通量較低、成本較高、速度較慢，對于大規(guī)模的病毒全基因組測序不太適用；(2)高通量測序技術(shù)：又稱新一代測序技術(shù)，主要包括第二代測序技術(shù)(如illumina測序)和第三代測序技術(shù)(如pacbio測序、nanopore測序)等。illumina測序方法優(yōu)點是通量高、成本低、準(zhǔn)確性較好，適用于大規(guī)模的病毒全基因組測序和群體遺傳學(xué)研究，缺點是讀長相對較短，對于較長的病毒基因組，需要進(jìn)行拼接組裝；pacbio測序方法的優(yōu)點是可以直接測定完整的病毒基因組，無需進(jìn)行復(fù)雜的拼接組裝，對于病毒基因組的結(jié)構(gòu)變異和重復(fù)序列的檢測具有優(yōu)勢，缺點是通量相對較低、成本較高，且測序錯誤率相對較高；nanopore測序方法的優(yōu)點是讀長較長、測序速度快、儀器便攜，可以在現(xiàn)場或野外進(jìn)行快速測序，對于實時監(jiān)測病毒的變異和傳播具有重要意義，缺點是通量相對較低、錯誤率相對較高，需要進(jìn)一步優(yōu)化數(shù)據(jù)處理方法來提高準(zhǔn)確性。

3、但現(xiàn)有的測序方法鮮少涉及美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組序列的測序，且沒有與美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組測序相關(guān)的疊瓦pcr引物序列的設(shè)計，因此，開發(fā)一種針對美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的三代全基因組測序的方法對疫病的診斷及其防控策略制定均具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的至少一個不足，提供一種用于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組測序的引物組合物、方法及其應(yīng)用，上述引物組合物及測序方法能夠?qū)崿F(xiàn)美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組全長在一個反應(yīng)體系中同時進(jìn)行擴增，無需進(jìn)行宿主核酸的去除，節(jié)約了實驗操作的時間。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：

3、本發(fā)明的第一個方面是提供一種引物組合物，其用于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因組全長擴增，其包括seq?id?no.1～seq?id?no.35所示序列。上述引物組合物為疊瓦pcr引物。

4、進(jìn)一步地，所述引物組合物分為a組引物和b組引物，所述a組引物由seq?id?no.1～seq?id?no.19所示序列組成，所述b組引物由seq?id?no.20～seq?id?no.35所示序列組成。

5、上述引物序列的具體信息如下表所示：

6、表1-疊瓦pcr引物

7、

8、

9、本發(fā)明的第二個方面是提供一種第一個方面中任一所述的引物組合物的試劑盒，其還包括逆轉(zhuǎn)錄試劑、擴增反應(yīng)試劑、產(chǎn)物純化試劑。

10、上述逆轉(zhuǎn)錄試劑具體可為lunascript?rt?supermix(5x)反轉(zhuǎn)錄混合液(neb，e3010s，含random?hexamer和poly-dt引物)，上述擴增反應(yīng)試劑具體可為kod?onetmpcrmaster?mix(kmm-101)，上述產(chǎn)物純化試劑包括磁珠。

11、本發(fā)明的第三個方面是提供一種美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組的測序方法，其包括如下步驟：

12、步驟s1、采集樣本，以從樣本中提取的病毒rna為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna；

13、步驟s2、以步驟s1得到的cdna為模板，采用擴增反應(yīng)試劑和第一個方面中任一所述的引物組合物進(jìn)行pcr反應(yīng)；

14、步驟s3、pcr反應(yīng)結(jié)束后，采用產(chǎn)物純化試劑，去除步驟s2中獲得的反應(yīng)產(chǎn)物中多余的雜質(zhì)；

15、步驟s4、將步驟s3獲得的純化產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建和序列測定。

16、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述樣本包括體液樣本、組織樣本、排泄物樣本。

17、進(jìn)一步地，所述步驟s1中，所述逆轉(zhuǎn)錄試劑為rt?supermix(5x)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為8μl病毒rna、2μl?rt?supermix(5x)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序為：25℃，2min；55℃，10min；95℃，1min。

18、進(jìn)一步地，步驟s2中，所述pcr反應(yīng)包括反應(yīng)體系a和反應(yīng)體系b，其中反應(yīng)體系a為8μl?a組引物、4.5μl?cdna、12.5μl?2x?pcr?master?mix；反應(yīng)體系b為8μl?b組引物、4.5μlcdna、12.5μl?2x?pcr?master?mix；其中，各組引物的濃度均為10μm；各反應(yīng)體系的反應(yīng)程序均為：94℃2min；98℃10s、58℃5s、68℃1min，35個循環(huán)；68℃5min。

19、進(jìn)一步地，步驟s3中，所述產(chǎn)物純化試劑包括磁珠，反應(yīng)產(chǎn)物a和反應(yīng)產(chǎn)物b中分別加入18μl磁珠進(jìn)行純化，并用20μl無核酸酶水收集純化產(chǎn)物a和純化產(chǎn)物b。

20、進(jìn)一步地，所述步驟s3中，純化產(chǎn)物達(dá)到納米孔測序的建庫的起始質(zhì)量和純度的要求。

21、進(jìn)一步地，所述步驟s4中，所述文庫構(gòu)建和序列測定具體包括：

22、步驟s41、在納米孔測序平臺上，采用sqk-lsk114.24試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建；

23、步驟s42、將步驟s41構(gòu)建好的文庫加樣到納米孔測序芯片上，設(shè)置好反應(yīng)程序，進(jìn)行測序；

24、步驟s43、對步驟s42獲得的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

25、進(jìn)一步地，所述步驟s41中，文庫構(gòu)建步驟包括：

26、a)末端修復(fù)：采用neb修復(fù)酶，其修復(fù)反應(yīng)體系為0.3μl末端修復(fù)酶、0.7μl末端修復(fù)酶緩沖液、30～100ng純化產(chǎn)物a、30～100ng純化產(chǎn)物b，無核酶水補足至7μl；反應(yīng)程序為：20℃2min，65℃5min；

27、b)標(biāo)簽連接：對每個樣本加上特異性的barcode標(biāo)簽序列，其反應(yīng)體系為：1μlbarcode標(biāo)簽、5μl?barcode預(yù)混液、4μl末端修復(fù)產(chǎn)物；室溫孵育10min后，加入7μl磁珠進(jìn)行純化，用6μl無核酶水收集連接barcode的混合產(chǎn)物；

28、c)測序接頭連接：反應(yīng)體系為2μl測序接頭、2μl?dna連接酶、4μl?neb緩沖液、12μl連接barcode的混合產(chǎn)物；其中，反應(yīng)體系中連接barcode的混合產(chǎn)物的用量為250ng，室溫孵育10min。

29、進(jìn)一步地，步驟s42中，納米孔測序芯片為flo-min114?r10.4.1，測序軟件為gridion。

30、進(jìn)一步地，步驟s43中，分析平臺為柏創(chuàng)翌豬繁殖與呼吸綜合征(prrsv)病毒生信分析云平臺。

31、本發(fā)明的第四個方面是提供一種第一個方面中任一所述的引物探針組合、或第二個方面中任一所述的試劑盒、或第三個方面中任一所述的測序方法在美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組測序中的應(yīng)用。

32、進(jìn)一步地，所述應(yīng)用包括美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期鑒定和基因分型。病毒的鑒定和分型可為了解病毒遺傳變異、研究病毒致病機理、疫苗研發(fā)、疾病防控策略制定等提供一定的依據(jù)。

33、本發(fā)明采用以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：

34、(1)利用本發(fā)明中的引物組合物，可有效富集并特異性的獲取美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒全基因組序列，比對到的目標(biāo)序列占下機數(shù)據(jù)的66.6％。另外，經(jīng)熒光定量pcr檢測ct值在30的低濃度樣本也能獲得平均深度1828×，覆蓋度99.853％的表現(xiàn)；

35、(2)本發(fā)明提供的全基因組擴增引物組合物和方法，成本較低，操作簡便，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，有利于美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒的早期鑒定和分型，從而可為制定疫病的防控措施及相關(guān)疫苗的開發(fā)提供依據(jù)。