本發(fā)明涉及生物工程，具體為一種發(fā)酵生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖的工藝。

背景技術(shù)：

1、母乳低聚糖(humanm?i?l?ko?l?i?gosacchar?i?des，hmos)是人類(lèi)母乳中的重要組成部分，其含量?jī)H次于乳糖和脂質(zhì)，特別是在初乳中含量更為豐富。研究表明，hmos對(duì)嬰幼兒的健康發(fā)育和免疫能力形成具有重要作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同，hmos可分為巖藻糖基化中性hmos、非巖藻糖基化中性hmos和唾液酸化酸性hmos。

2、3’-唾液酸乳糖(3’-s?i?a?l?y?l?l?actose，3’-sl)是hmos中含量最豐富的唾液酸化低聚糖之一，也是唾液酸化酸性hmos的代表性分子。3’-sl由n-乙酰神經(jīng)氨酸(neu5ac)和乳糖單元組成，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單且具有多種重要的生物活性功能，如促進(jìn)腸道中有益細(xì)菌的生長(zhǎng)、抑制致病菌粘附、抗炎、抗病毒及抗菌等。此外，3’-sl還可用于預(yù)防壞死性小腸結(jié)腸炎、增強(qiáng)免疫功能和促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

3、目前，僅在人類(lèi)母乳中可以檢測(cè)到較高含量的3’-sl，而其他哺乳動(dòng)物母乳中的含量微乎其微。從人乳中提取和純化3’-sl的過(guò)程復(fù)雜且成本高昂，不適合規(guī)?；a(chǎn)?；瘜W(xué)合成法雖然能夠獲得一定量的3’-sl，但由于涉及多步保護(hù)和去保護(hù)反應(yīng)，工藝復(fù)雜且生產(chǎn)成本過(guò)高。而酶合成法雖避免了化學(xué)法的復(fù)雜步驟，但由于需要對(duì)酶進(jìn)行純化和固定化處理，其價(jià)格同樣高昂，且在大規(guī)模生產(chǎn)中受到限制。

4、微生物合成法被認(rèn)為是生產(chǎn)3’-sl的一種安全、經(jīng)濟(jì)且易于規(guī)?；耐緩健Ｍㄟ^(guò)代謝工程和發(fā)酵技術(shù)，能夠?qū)⑽⑸镛D(zhuǎn)化為高效的3’-sl合成工廠。然而，目前的微生物發(fā)酵工藝仍面臨許多挑戰(zhàn)：

5、現(xiàn)有技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀及不足：

6、多菌種耦合技術(shù)：

7、例如江南大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了三菌耦合體系，通過(guò)優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，在3l生物反應(yīng)器中實(shí)現(xiàn)了44.2g/l的3’-sl產(chǎn)量。然而，該方法依賴于多菌種協(xié)同發(fā)酵，不同菌株的培養(yǎng)條件、發(fā)酵參數(shù)及培養(yǎng)基成分均需獨(dú)立優(yōu)化，且發(fā)酵過(guò)程中菌株易退化、調(diào)控復(fù)雜、發(fā)酵周期較長(zhǎng)，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。

8、基因敲除與表達(dá)策略：

9、專利cn106190938a通過(guò)敲除7個(gè)基因并過(guò)表達(dá)5個(gè)基因，使代謝流向3’-sl的路徑增強(qiáng)，獲得了2～4g/l的3’-sl。然而，該方法需依賴多種抗生素來(lái)維持遺傳穩(wěn)定性，顯著增加了工業(yè)化生產(chǎn)成本。

10、專利cn107904253a則敲除了大腸桿菌中的聚唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因(neus)、β-半乳糖苷酶基因(l?acz)及n-乙酰神經(jīng)氨酸代謝相關(guān)基因簇(nanketa)，并過(guò)表達(dá)唾液酸轉(zhuǎn)移酶基因(nst)，以此合成3’-sl。然而，其培養(yǎng)基配方復(fù)雜，包括多種碳源(甘油、葡萄糖、阿拉伯糖)及胰蛋白胨，導(dǎo)致成本較高。此外，該發(fā)酵體系未進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵，其最終產(chǎn)量未知。

11、專利cn114874966a基于基因編輯技術(shù)敲除了多種與底物降解和中間產(chǎn)物分流相關(guān)的基因，在5l發(fā)酵罐條件下，分批補(bǔ)料38.5h可獲得31.4g/l的3’-sl。然而，該培養(yǎng)基以甘油為主要碳源，相較于以純葡萄糖為碳源，成本較高。

12、產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中的挑戰(zhàn)：

13、目前的研究大多集中于菌株代謝途徑優(yōu)化，而針對(duì)工業(yè)化發(fā)酵和純化策略的研究較少。多菌種體系或復(fù)雜培養(yǎng)基的高成本、高能耗問(wèn)題在規(guī)?；a(chǎn)中尤為突出。國(guó)外部分企業(yè)(如dsm、dupont、jennewei?n等)已開(kāi)發(fā)了商業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，但其工藝細(xì)節(jié)未公開(kāi)，難以借鑒。

14、本發(fā)明針對(duì)的問(wèn)題：

15、現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于3’-sl的工業(yè)化生產(chǎn)仍存在以下問(wèn)題：

16、培養(yǎng)基配方復(fù)雜且成本高；

17、工藝流程復(fù)雜，操作難度大，過(guò)程調(diào)控性差；

18、副產(chǎn)物較多，影響目標(biāo)產(chǎn)物的提取純化；

19、發(fā)酵周期較長(zhǎng)，限制了大規(guī)模生產(chǎn)的效率。

20、因此，本發(fā)明提出一種發(fā)酵生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖的工藝，來(lái)解決現(xiàn)有技術(shù)的不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中培養(yǎng)基配方復(fù)雜、生產(chǎn)成本高、工藝流程繁瑣、過(guò)程調(diào)控性差、副產(chǎn)物較多及發(fā)酵周期較長(zhǎng)等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖的工藝。通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基組成、精準(zhǔn)控制發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵參數(shù)以及改進(jìn)補(bǔ)料策略，顯著提升3’-sl的產(chǎn)量，同時(shí)降低生產(chǎn)成本并簡(jiǎn)化工藝流程，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供了新的解決方案。

2、為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：一種發(fā)酵生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖的工藝，所述工藝包括以下步驟：

3、溶液制備：制備蔗糖與磷酸氫二鈉混合溶液，以及基礎(chǔ)培養(yǎng)基；

4、菌種復(fù)蘇：將重組大腸桿菌從冷凍狀態(tài)下取出，置于25-30℃水浴條件下融化后，轉(zhuǎn)接至新鮮培養(yǎng)基中，在20-30℃條件下培養(yǎng)3-6小時(shí)；

5、發(fā)酵初期：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基和復(fù)蘇后的菌種加入發(fā)酵罐中，在設(shè)定條件下開(kāi)始發(fā)酵；

6、控制發(fā)酵初期環(huán)境條件，為菌種提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境，減少應(yīng)激影響；

7、平衡菌體生長(zhǎng)與代謝，使代謝流向逐步向目標(biāo)產(chǎn)物3’-sl傾斜；

8、為后續(xù)誘導(dǎo)提供高效生物量。

9、第一次誘導(dǎo)：當(dāng)發(fā)酵液光密度達(dá)到10-20時(shí)，加入誘導(dǎo)劑和乳糖溶液；

10、補(bǔ)料：根據(jù)發(fā)酵階段，將蔗糖與磷酸氫二鈉混合溶液以不同速度持續(xù)加入發(fā)酵罐；

11、第二次誘導(dǎo)：完成第一次誘導(dǎo)20-30小時(shí)后，再次加入誘導(dǎo)劑和乳糖溶液；

12、延續(xù)目標(biāo)代謝通路的活性，提高3’-sl終產(chǎn)量；

13、控制乳糖用量，避免代謝抑制和副產(chǎn)物過(guò)度累積；

14、通過(guò)分階段誘導(dǎo)提高發(fā)酵的可控性和穩(wěn)定性。

15、發(fā)酵后期：停止補(bǔ)料，并保持發(fā)酵至目標(biāo)產(chǎn)品濃度。

16、停止補(bǔ)料后避免副產(chǎn)物(如乳酸、乙酸)的積累，優(yōu)化目標(biāo)產(chǎn)物純度；

17、減少下游提取和純化的難度，降低整體生產(chǎn)成本；

18、確保目標(biāo)產(chǎn)物3’-sl達(dá)到最大濃度，提升工業(yè)化生產(chǎn)效率。

19、優(yōu)選的，所述溶液制備步驟包括：

20、將67kg蔗糖與100-110g磷酸氫二鈉溶于20-30l水中，配制成蔗糖與磷酸氫二鈉混合溶液；

21、將2000-3000g蔗糖、50-70g磷酸二氫鉀、30-50g磷酸氫二鈉、8-12g七水硫酸鎂、23g檸檬酸三鐵和0.52g五水硫酸銅溶于15-25l水中，配制成基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

22、配方中蔗糖作為主要碳源，價(jià)格低廉且易于利用，顯著降低了發(fā)酵成本；

23、精確的磷酸鹽比例為菌體提供穩(wěn)定的磷平衡，促進(jìn)菌種的高效代謝；

24、七水硫酸鎂和檸檬酸三鐵提供的微量元素能優(yōu)化菌體酶系統(tǒng)的活性，提高目標(biāo)代謝物3’-sl的合成效率。

25、優(yōu)選的，所述菌種復(fù)蘇步驟中，以重組大腸桿菌為菌種，冷凍菌株復(fù)蘇后，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)間為3-6小時(shí)，培養(yǎng)溫度為20-30℃。

26、控制復(fù)蘇條件，避免菌株受到環(huán)境應(yīng)激影響，提升菌株活性；

27、減少代謝損耗，為后續(xù)發(fā)酵提供健康且高效的菌種；

28、確保菌體狀態(tài)均一性，提高發(fā)酵過(guò)程的穩(wěn)定性。

29、優(yōu)選的，所述第一次誘導(dǎo)步驟包括：當(dāng)發(fā)酵液光密度值達(dá)到10-20時(shí)，加入1.5-2.5l的180-220g/l乳糖溶液和誘導(dǎo)劑。

30、控制誘導(dǎo)時(shí)機(jī)(od值范圍)確保菌體具備足夠生長(zhǎng)活性，避免提前誘導(dǎo)導(dǎo)致代謝負(fù)擔(dān)；

31、乳糖濃度優(yōu)化，平衡代謝流向，提升目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量；

32、誘導(dǎo)劑用量精準(zhǔn)，降低誘導(dǎo)劑成本的同時(shí)最大化代謝效率。

33、優(yōu)選的，所述補(bǔ)料步驟包括以下階段：

34、第一階段補(bǔ)料：在第一次誘導(dǎo)后，向發(fā)酵罐中以180-220ml/h的速度加入蔗糖與磷酸氫二鈉混合溶液，持續(xù)6-10小時(shí)；

35、第二階段補(bǔ)料：在第一階段補(bǔ)料結(jié)束后，以250-350ml/h的速度加入蔗糖與磷酸氫二鈉混合溶液，持續(xù)14-18小時(shí)；

36、第三階段補(bǔ)料：在第二次誘導(dǎo)后，以500-700ml/h的速度加入蔗糖與磷酸氫二鈉混合溶液，持續(xù)28-35小時(shí)。

37、精確控制補(bǔ)料速率，避免過(guò)量碳源引發(fā)代謝紊亂或副產(chǎn)物積累；

38、優(yōu)化菌體代謝動(dòng)態(tài)，提高乳糖的利用率，減少碳源浪費(fèi)；

39、增加目標(biāo)產(chǎn)物3’-sl的積累量，同時(shí)減少乳酸、乙酸等副產(chǎn)物。

40、優(yōu)選的，所述第二次誘導(dǎo)步驟中，在完成第一次誘導(dǎo)20-30小時(shí)后，再次加入1.52.5l的180-220g/l乳糖溶液和與第一次誘導(dǎo)相同劑量的誘導(dǎo)劑。

41、優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)劑為異丙基-β-d-硫代半乳糖苷，使用濃度為0.1～1.0mmo?l/l。

42、優(yōu)選的，所述發(fā)酵罐體積為80-120l，發(fā)酵溫度為28-32℃，發(fā)酵液ph值控制在6.0-7.5范圍內(nèi)。

43、優(yōu)選的，所述發(fā)酵液的光密度值達(dá)到10-20時(shí)進(jìn)行第一次誘導(dǎo)，完成第一次誘導(dǎo)后20-30小時(shí)進(jìn)行第二次誘導(dǎo)。

44、通過(guò)上述工藝，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了以下技術(shù)效果：

45、高產(chǎn)量：優(yōu)化工藝后，3’-sl產(chǎn)量可達(dá)到42-45g/l，顯著高于現(xiàn)有技術(shù)水平；

46、高純度：副產(chǎn)物乳糖和唾液酸的雜質(zhì)含量顯著降低至1％-2％，提高了目標(biāo)產(chǎn)物的純度；

47、低成本：采用蔗糖為主要碳源、優(yōu)化誘導(dǎo)劑用量，減少了培養(yǎng)基和誘導(dǎo)劑的使用成本；

48、可規(guī)模化：精確控制誘導(dǎo)和補(bǔ)料策略，降低工藝復(fù)雜性，適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

49、本發(fā)明提供了一種高效、經(jīng)濟(jì)且綠色的3’-sl生產(chǎn)工藝，為功能性食品和藥物開(kāi)發(fā)提供了重要的技術(shù)支持。

50、本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)3’-唾液酸乳糖的工藝。具備以下有益效果：

51、1、本發(fā)明采用以蔗糖或葡萄糖為主要碳源，并配合常見(jiàn)的無(wú)機(jī)鹽(如磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等)和微量元素(如硫酸銅、檸檬酸鐵等)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方，達(dá)到了顯著降低培養(yǎng)基成本、簡(jiǎn)化配制工藝的技術(shù)效果。相較于現(xiàn)有技術(shù)中普遍依賴于甘油、多種混合碳源(如甘油、葡萄糖、阿拉伯糖)以及復(fù)雜有機(jī)物(如胰蛋白胨)的高成本配方，本發(fā)明解決了培養(yǎng)基配方復(fù)雜、成本高昂以及培養(yǎng)基組分穩(wěn)定性不足的問(wèn)題，使得培養(yǎng)基在規(guī)模化生產(chǎn)中更具經(jīng)濟(jì)性和可操作性。同時(shí)，本發(fā)明的培養(yǎng)基成分明確且易于保存，有助于保證發(fā)酵工藝的穩(wěn)定性。

52、2、本發(fā)明通過(guò)以發(fā)酵液光密度(od值)為參考，在發(fā)酵初期和中后期分兩次精準(zhǔn)誘導(dǎo)目標(biāo)產(chǎn)物表達(dá)，并結(jié)合多階段補(bǔ)料技術(shù)(根據(jù)菌株的代謝需求，以不同速率補(bǔ)充碳源和磷酸鹽)，達(dá)到了持續(xù)優(yōu)化代謝流向和顯著提升3’-唾液酸乳糖(3’-sl)產(chǎn)量的技術(shù)效果。相較于現(xiàn)有技術(shù)中誘導(dǎo)條件不精確、補(bǔ)料方法單一或速率控制不當(dāng)(如補(bǔ)料過(guò)快導(dǎo)致代謝負(fù)擔(dān)或補(bǔ)料過(guò)慢限制菌株生長(zhǎng))的技術(shù)方案，本發(fā)明有效解決了過(guò)程調(diào)控性差、代謝流向不集中以及目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量偏低的不足。特別是，分階段補(bǔ)料技術(shù)進(jìn)一步避免了培養(yǎng)基中碳源過(guò)量積累所帶來(lái)的代謝抑制現(xiàn)象，使得3’-sl的終產(chǎn)量顯著提升。

53、3、本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)(包括補(bǔ)料速率、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、ph值和發(fā)酵溫度等)并采用高密度發(fā)酵技術(shù)，達(dá)到了在較短發(fā)酵周期內(nèi)實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)3’-唾液酸乳糖的技術(shù)效果。相較于現(xiàn)有技術(shù)中如多菌種耦合體系因菌株協(xié)同復(fù)雜性帶來(lái)的周期延長(zhǎng)(如多菌株培養(yǎng)條件不統(tǒng)一導(dǎo)致的發(fā)酵協(xié)調(diào)性差)，本發(fā)明顯著解決了生產(chǎn)周期長(zhǎng)、菌種退化和培養(yǎng)條件難以統(tǒng)一等不足。同時(shí)，通過(guò)精細(xì)化調(diào)控發(fā)酵過(guò)程，本發(fā)明有效縮短了發(fā)酵時(shí)間，從而提升了工業(yè)化生產(chǎn)的整體效率和經(jīng)濟(jì)性。

54、4、本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化補(bǔ)料策略和誘導(dǎo)條件，減少了發(fā)酵液中副產(chǎn)物(如有機(jī)酸等)的生成，達(dá)到了降低雜質(zhì)含量、簡(jiǎn)化目標(biāo)產(chǎn)物3’-唾液酸乳糖的提取純化過(guò)程的技術(shù)效果。相較于現(xiàn)有技術(shù)中由于補(bǔ)料速率不當(dāng)或菌株代謝負(fù)擔(dān)過(guò)重引起的代謝旁路增強(qiáng)，導(dǎo)致發(fā)酵液中副產(chǎn)物(如乳酸或乙酸)含量較高的技術(shù)方案，本發(fā)明解決了目標(biāo)產(chǎn)物提取難度大、純化步驟繁瑣且成本高的問(wèn)題。同時(shí)，本發(fā)明的副產(chǎn)物減少還具有環(huán)保優(yōu)勢(shì)，可有效減少發(fā)酵液中廢棄物的處理難度和環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)，為綠色生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。