本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，具體涉及一種高產(chǎn)質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、公開(kāi)該背景技術(shù)部分的信息僅僅旨在增加對(duì)本發(fā)明的總體背景的理解，而不必然被視為承認(rèn)或以任何形式暗示該信息構(gòu)成已經(jīng)成為本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所公知的現(xiàn)有技術(shù)。

2、質(zhì)粒dna?(pdna)是制藥工業(yè)的重要產(chǎn)品，主要用作轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞的載體。pdna可以以dna疫苗的形式直接注射入體內(nèi)。此外，pdna是生產(chǎn)mrna疫苗的重要原料，如針對(duì)sars-cov-2的疫苗。質(zhì)粒dna?(pdna)是未來(lái)疫苗的基礎(chǔ)，因?yàn)樗梢詫?shí)現(xiàn)有效的免疫。pdna疫苗由編碼一種或幾種病原體抗原的pdna組成，可以直接注射到宿主體內(nèi)，而不像其他疫苗利用蛋白質(zhì)抗原或減毒/死亡病原體。與基于病毒的載體相比，pdna疫苗的生產(chǎn)速度更快，并且具有更出色的安全性。dna疫苗已被成功用于治療許多疾病，如瘧疾、結(jié)核病、肝炎、流感和利什曼病。一些pdna已被批準(zhǔn)用于獸醫(yī)的疫苗或基因療法。pdna還可作為基因和細(xì)胞治療的載體。無(wú)論何種應(yīng)用，都需要大量和高質(zhì)量的pdna，優(yōu)化pdna生產(chǎn)具有較高經(jīng)濟(jì)效益，因?yàn)閜dna是相關(guān)產(chǎn)品制造的主要成本。

3、然而現(xiàn)有技術(shù)中質(zhì)粒生產(chǎn)的產(chǎn)能仍然有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明基于大腸桿菌菌株dh5α，以提升質(zhì)粒產(chǎn)量為目的，提供一種高產(chǎn)質(zhì)粒的大腸桿菌重組菌株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，利用本發(fā)明提供的大腸桿菌重組菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，可以提高質(zhì)粒復(fù)制底物供給和質(zhì)粒復(fù)制起始，從而可以有效提高質(zhì)粒生產(chǎn)的產(chǎn)能，降低生產(chǎn)成本。

2、具體地，本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

3、本發(fā)明的第一方面，提供一種大腸桿菌重組菌株，所述大腸桿菌重組菌株是以eschrichia?coli?dh5α為原始菌株，在其基因組上過(guò)表達(dá)rnaii得到的。

4、在一種具體的實(shí)施方式中，所述大腸桿菌重組菌株的基因組上包含rnaii、nrdab或rnaii-nrdab基因中的一種或多種。

5、優(yōu)選地，所述大腸桿菌重組菌株的基因組上包含rnaii基因；

6、優(yōu)選地，所述大腸桿菌重組菌株的基因組上包含nrdab基因；

7、優(yōu)選地，所述大腸桿菌重組菌株的基因組上包含rnaii和nrdab基因。

8、在一種具體的實(shí)施方式中，所述原始菌株eschrichia?coli?dh5α的基因組序列號(hào)為nz_cp025520。

9、在本發(fā)明的第二方面，提供一種第一方面所述大腸桿菌重組菌株的構(gòu)建方法，所述方法包括：

10、構(gòu)建質(zhì)粒phk-rnaii、phk-nrdab和phk-rnaii-nrdab；

11、將所述質(zhì)粒phk-rnaii、phk-nrdab或phk-rnaii-nrdab分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入帶有pah69質(zhì)粒的eschrichia?coli?dh5α感受態(tài)菌株中，得到所述大腸桿菌重組菌株。

12、在一種具體的實(shí)施方式中，所述構(gòu)建質(zhì)粒phk-rnaii、phk-nrdab和phk-rnaii-nrdab包括：

13、（1）以eschrichia?coli?dh5α基因組、phk-arac-t4-t5為模板，使用phk-rnaii-f/phk-rnaii-r/23103-nrdab-f1/phk-23103-nrdab-f2/phk-nrdab-r/phk-f/phk-r進(jìn)行pcr（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增得到片段nrdab、rnaii和phk；其中，phk-rnaii-f具有如seq?idno.3所示的核苷酸序列，phk-rnaii-r具有如seq?id?no.4所示的核苷酸序列，23103-nrdab-f1具有如seq?id?no.8所示的核苷酸序列，phk-23103-nrdab-f2具有如seq?id?no.9所示的核苷酸序列，phk-nrdab-r具有如seq?id?no.11所示的核苷酸序列，phk-f/phk-r具有如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示的核苷酸序列；

14、（2）將上述片段nrdab、rnaii和phk通過(guò)dpni內(nèi)切酶消化后，回收純化，將回收純化后的片段nrdab、rnaii和phk連接，構(gòu)建質(zhì)粒phk-rnaii、phk-nrdab和phk-rnaii-nrdab。

15、在一種具體的實(shí)施方式中，所述將所述質(zhì)粒phk-rnaii、phk-nrdab或phk-rnaii-nrdab分別轉(zhuǎn)化進(jìn)入帶有pah69質(zhì)粒的eschrichia?coli?dh5α感受態(tài)菌株中，得到所述大腸桿菌重組菌株包括：

16、（1）分別取phk-rnaii、phk-nrdab和phk-rnaii-nrdab質(zhì)粒，加入感受態(tài)菌株中，培養(yǎng)后得到菌液，將菌液涂在卡那霉素固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；

17、（2）將所述固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落分別挑在氨芐西林、卡那霉素固體培養(yǎng)基上，過(guò)夜培養(yǎng)后，選擇只在卡那霉素固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的單菌落進(jìn)行菌落pcr鑒定；

18、（3）選擇單拷貝菌株轉(zhuǎn)入pcp20質(zhì)粒，氨芐西林或氯霉素抗性固體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，之后挑取單克隆轉(zhuǎn)入lb培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在lb固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)分離單菌落；將單菌落分別挑在卡那霉素、氨芐西林/氯霉素、無(wú)抗生素固體培養(yǎng)基上，選取只在無(wú)抗性固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌株，轉(zhuǎn)入plp1質(zhì)粒，得到目的菌株大腸桿菌重組菌株。

19、在本發(fā)明的第三方面，提供一種第一方面所述大腸桿菌重組菌株在質(zhì)粒制備中的應(yīng)用。

20、在本發(fā)明的第四方面，提供一種利用第一方面所述大腸桿菌重組菌株生產(chǎn)質(zhì)粒的方法，所述方法包括以下步驟：

21、（1）將所述大腸桿菌重組菌株接種至卡那抗性lb液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌體od600達(dá)到3.0~4.0，得到種子液；

22、（2）在發(fā)酵培養(yǎng)基上接種所述種子液，培養(yǎng)收獲發(fā)酵液，從所述發(fā)酵液中進(jìn)行質(zhì)粒提取得到質(zhì)粒。

23、在一種具體的實(shí)施方式中，步驟（1）中培養(yǎng)的條件為：37℃、200?rpm培養(yǎng)11~13?h；

24、在一種具體的實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：胰蛋白胨12.0?g/l、酵母粉24?g/l、磷酸二氫鉀3.8?g/l、磷酸氫二鉀16.38?g/l、七水硫酸鎂1.03?g/l、葡萄糖?30?g/l、卡那霉素50?μg/ml。

25、在一種具體的實(shí)施方式中，步驟（2）中，在發(fā)酵培養(yǎng)基上按照1~3%接種量接種所述種子液；

26、在一種具體的實(shí)施方式中，步驟（2）中，培養(yǎng)得到發(fā)酵液的條件為：37℃、200?rpm進(jìn)行培養(yǎng)，每隔6h使用氨水將ph調(diào)整至6.0~8.0；培養(yǎng)24?h收獲發(fā)酵液。

27、在本發(fā)明的第五方面，提供一種利用第一方面所述大腸桿菌重組菌株生產(chǎn)質(zhì)粒的方法，所述方法包括以下步驟：

28、將所述大腸桿菌重組菌株接種至卡那抗性lb液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌體od600達(dá)到3.0~4.0，得到種子液；

29、將所述種子液全部接種至2?l發(fā)酵罐中，發(fā)酵參數(shù)設(shè)定為培養(yǎng)溫度37℃、ph?7.0，溶氧控制40%聯(lián)動(dòng)轉(zhuǎn)速300~800?rpm，壓縮空氣通氣量1~3?lpm，氧氣0~1?lpm；經(jīng)過(guò)10?h發(fā)酵，菌體od600至113.7。

30、本發(fā)明具有以下有益效果：

31、本發(fā)明通過(guò)對(duì)大腸桿菌dh5α進(jìn)行工程改造，在其基因組上過(guò)表達(dá)rnaii，增強(qiáng)質(zhì)粒復(fù)制起始，通過(guò)優(yōu)化啟動(dòng)子強(qiáng)度，平衡質(zhì)粒生產(chǎn)和菌株生長(zhǎng)，提高了質(zhì)粒產(chǎn)量，通過(guò)在基因組上過(guò)表達(dá)nrdab基因，增強(qiáng)dntp合成，進(jìn)一步提高了質(zhì)粒產(chǎn)量，在2l發(fā)酵罐上質(zhì)粒產(chǎn)量達(dá)到了2.20?g/l。