本發(fā)明屬于干細(xì)胞，特別涉及一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、藥物研發(fā)經(jīng)歷了小分子化學(xué)藥、大分子生物藥和生物藥的不同階段。生物藥是從生物體中提取或者通過生物工程的方法合成的藥物，在本質(zhì)上區(qū)別于傳統(tǒng)的可以完全人工合成的化學(xué)藥物，傳統(tǒng)化學(xué)藥一般是小分子，生物藥一般是復(fù)雜混合物或生物大分子，具有良好療效和安全性，可分為抗體藥物、細(xì)胞因子、血液制品、基因和細(xì)胞治療藥物、酶及激素等幾大類。其中細(xì)胞治療藥物是全球近幾年來最為熱門的藥物研發(fā)領(lǐng)域之一。細(xì)胞治療藥物按照細(xì)胞種類可分為干細(xì)胞治療和免疫細(xì)胞治療。干細(xì)胞是具有多向分化潛能、自我更新能力的細(xì)胞，是處于細(xì)胞發(fā)育譜系起源頂端的最原始細(xì)胞，在體內(nèi)能夠分化成某種特定組織類型的細(xì)胞，用于臨床治療的干細(xì)胞種類主要有骨髓干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞、胰島干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等。干細(xì)胞治療是利用人體干細(xì)胞的分化和修復(fù)原理，把健康的干細(xì)胞移植到體內(nèi)，以達(dá)到修復(fù)病變細(xì)胞或重建功能正常的細(xì)胞和組織的目的。

2、免疫細(xì)胞是負(fù)責(zé)殺滅對人體有害的入侵者，包括人體的t細(xì)胞、nk細(xì)胞、b細(xì)胞、dc細(xì)胞等。免疫細(xì)胞治療是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，或者是對免疫細(xì)胞進(jìn)行改造，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力。

3、間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal?stem?cell,?msc）是具有多向誘導(dǎo)分化潛能的干細(xì)胞，根據(jù)國際細(xì)胞治療協(xié)會對間充質(zhì)干細(xì)胞最低標(biāo)準(zhǔn)的定義，間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)具備以下特點(diǎn)：①在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，須具有對塑料性質(zhì)底物的黏附特性；②通過流式細(xì)胞術(shù)檢測間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物中cd105、cd73及cd90表達(dá)的陽性率≥95%，且cd45、cd34、cd14或cd11b、cd79a或cd19、hla-dr表達(dá)的陽性率≤2%；③在體外通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行誘導(dǎo)后，間充質(zhì)干細(xì)胞能誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞等。間充質(zhì)干細(xì)胞的三向誘導(dǎo)分化，是鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞最低標(biāo)準(zhǔn)之一，但是在不同種屬、不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞中，其三向分化能力存在較大差異。尤其是在成軟骨誘導(dǎo)分化中，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（umbilical?cord?mesenchymal?stem?cells,?uc-mscs）較脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adiposederived?mesenchymal?stem?cells,?adscs）、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone?marrowmesenchymal?stem?cells,?bmscs）具有誘導(dǎo)分化周期漫長，內(nèi)酸性粘多糖形成緩慢，內(nèi)酸性粘多糖數(shù)量極少且內(nèi)酸性粘多糖極小等特點(diǎn)。?針對臍帶間充質(zhì)成軟骨誘導(dǎo)分化特點(diǎn)，本發(fā)明提出一種能夠促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞高效成軟骨誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基，可有效促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)酸性粘多糖形成，同時能夠增加內(nèi)酸性粘多糖數(shù)量和內(nèi)酸性粘多糖大小，并加速成軟骨誘導(dǎo)分化周期，解決了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞三向分化鑒定中，成軟骨誘導(dǎo)分化內(nèi)酸性粘多糖形成緩慢，內(nèi)酸性粘多糖數(shù)量極少、內(nèi)酸性粘多糖極小等問題。

4、zuk等（zuk?p?a?,?zhu?m?,?mizuno?h?,et?al.?multilineage?cells?fromhuman?adipose?tissue:?implications?for?cell-basedtherapies.[j].tissueengineering?part?a,?2001,?7(2):211-228.）在2001年提出了經(jīng)典的成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，含dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基、10%胎牛血清、胰島素6.25μg/ml、維生素c?50nm、tgf-β1?10ng/ml，該成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化中，形成了較多、較大的內(nèi)酸性粘多糖，但在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化中，內(nèi)酸性粘多糖形成極少、極小，加長誘導(dǎo)時間至脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化的2-3倍，且存在誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組在阿利新藍(lán)染色后沒有明顯差異的問題，誘導(dǎo)效果仍不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基及應(yīng)用，通過將阿肽地爾按照一定濃度加入到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，阿肽地爾與其他成分協(xié)同可有效促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)酸性粘多糖形成，同時能夠增加內(nèi)酸性粘多糖數(shù)量和自發(fā)形成軟骨球的大小，并加速成軟骨誘導(dǎo)分化周期，解決了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞三向分化鑒定中，成軟骨誘導(dǎo)分化內(nèi)酸性粘多糖形成緩慢，內(nèi)酸性粘多糖數(shù)量極少、自發(fā)形成軟骨球體積困難、體積小等問題。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

3、一方面，本發(fā)明提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、誘導(dǎo)因子和添加因子；所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括：dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清和脯氨酸；所述誘導(dǎo)因子包括：its、tgf-β3、地塞米松和維生素c；所述添加因子包括：阿肽地爾。

4、進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，胎牛血清：總體積的0.5-15%，脯氨酸10-400μg/ml。

5、進(jìn)一步地，所述誘導(dǎo)因子中，its：0.1-20×，tgf-β3：0.1-30ng/ml，地塞米松：0.01-20μm，維生素c：10-200μg/ml。

6、進(jìn)一步地，阿肽地爾：1-200ng/ml。

7、進(jìn)一步地，胎牛血清：總體積的0.75-5%，地塞米松：0.02-5μm，維生素c：20-120μg/ml，脯氨酸：20-200μg/ml，its：0.2-10×，tgf-β3：5-20ng/ml，阿肽地爾50-100ng/ml。

8、進(jìn)一步地，胎牛血清：總體積的1-2%，地塞米松：0.03-0.2μm，維生素c：40-70μg/ml，脯氨酸：30-60μg/ml，its：0.5-3×，tgf-β3：8-15ng/ml，阿肽地爾：70-80ng/ml。

9、另一方面，本發(fā)明提供了一種配制上述臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的方法，所述方法包括：按照配比向dmem基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入胎牛血清和脯氨酸，混合攪拌均勻；隨后加入its、tgf-β3、地塞米松和維生素c，混合攪拌均勻；最后加入阿肽地爾，混合攪拌均勻后即得。

10、另一方面，本發(fā)明提供了一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成軟骨的方法，包括：將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于如上述培養(yǎng)基中并進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到成軟骨細(xì)胞。

11、進(jìn)一步的，將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種于如上述任一所述的培養(yǎng)基中；每隔3-4天更換新的如上述任一所述的培養(yǎng)基；誘導(dǎo)分化周期為14-21天，誘導(dǎo)分化完成后得到成軟骨細(xì)胞。

12、另一方面，本發(fā)明提供了一種成軟骨細(xì)胞，所述成軟骨細(xì)胞采用上述的培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞而得到，或采用上述方法制備而得。

13、本發(fā)明實(shí)施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果包括：

14、本發(fā)明通過將阿肽地爾按照一定濃度加入到臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中，阿肽地爾與其他成分協(xié)同可有效促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)酸性粘多糖形成，同時能夠增加內(nèi)酸性粘多糖數(shù)量和自發(fā)形成軟骨球的大小，并加速成軟骨誘導(dǎo)分化周期，解決了臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞三向分化鑒定中，成軟骨誘導(dǎo)分化內(nèi)酸性粘多糖形成緩慢，內(nèi)酸性粘多糖數(shù)量極少、自發(fā)形成軟骨球體積困難、體積小等問題，具體的，粘多糖可以通過阿利新藍(lán)染色呈藍(lán)色，通過imagej軟件對染色區(qū)域進(jìn)行灰度分析，本發(fā)明在相同的誘導(dǎo)時間內(nèi)可以使灰度增強(qiáng)至少兩倍以上，所制備的內(nèi)酸性粘多糖相對粘度增加至少45%。