本發(fā)明屬于生物工程，尤其是涉及一種提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、世界衛(wèi)生組織認(rèn)為母乳喂養(yǎng)對(duì)于新生兒的健康生長十分重要，這主要?dú)w益于其營養(yǎng)和生物活性成分，包括人乳寡糖（hmos）。hmos提供了多種生理功能，包括建立平衡的嬰兒腸道微生物群、加強(qiáng)胃腸道屏障、預(yù)防感染，以及潛在地支持免疫系統(tǒng)、大腦和認(rèn)知發(fā)展。二巖藻糖基乳糖（dfl）是典型的巖藻糖基化hmos之一。dfl不僅促進(jìn)新生兒的生長發(fā)育，還具有重要的抗菌活性。相較于2'-fl和3-fl，它可以顯著抑制b組鏈球菌（gbs）的生長和繁殖。同時(shí)，dfl還可以抑制血小板促炎蛋白的釋放，此外，dfl已被證明可以通過選擇性促進(jìn)雙歧桿菌的定植來促進(jìn)腸道健康。迄今為止，dfl已被歐洲食品安全局（efsa）和美國食品藥品監(jiān)督管理局（fda）批準(zhǔn)并授權(quán)為新的食品添加劑。

2、目前，dfl的合成方法包括化學(xué)合成法、酶法合成和微生物合成法。通過化學(xué)方法合成dfl需要化學(xué)試劑和嚴(yán)苛的反應(yīng)條件，既不環(huán)保也不經(jīng)濟(jì)。相比之下，生物合成方法只需要溫和的條件和低成本的試劑，為dfl的合成提供了一種更經(jīng)濟(jì)、更環(huán)保的策略。目前通過微生物細(xì)胞工廠獲得的dfl產(chǎn)量仍較低，本發(fā)明旨在利用合成生物學(xué)手段，通過弱化代謝分支途徑、增強(qiáng)前體合成途徑、融合蛋白等策略構(gòu)建一株可以提高dfl產(chǎn)量的高產(chǎn)菌株，以期實(shí)現(xiàn)dfl的高效合成。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌構(gòu)建及應(yīng)用。

2、本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌，以大腸桿菌為底盤宿主，敲除編碼β半乳糖苷酶基因 lacz、編碼外膜多糖輸出蛋白基因 wza、敲除編碼蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶基因 wzb、敲除編碼蛋白酪氨酸激酶基因 wzc、敲除編碼udp-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因 wcaa、敲除編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因 wcac、敲除編碼可拉酸聚合酶基因 wcad、敲除編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 wcae、敲除編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 wcaf；

3、敲除編碼udp-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因 wcaj、敲除編碼腸桿菌共同抗原聚合酶基因 wzye、敲除編碼dtdp-4-氨基-4,6-雙脫氧-d-葡萄糖轉(zhuǎn)氨酶基因 vioa、敲除編碼咪唑甘油磷酸合成酶基因 hisf、敲除編碼udp-n-乙酰-d-甘露糖胺糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因 wecg、敲除編碼α-d-乙酰氨基葡萄糖-焦磷酸-多萜醇β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因 wbbd、敲除編碼dtdp-葡萄糖?4,6-脫水酶基因 rffg；

4、向底盤宿主基因組中整合編碼磷酸甘露糖變位酶基因 manb、整合編碼甘露糖-1-磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶基因 manc、整合編碼gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶基因 gmd、整合編碼gdp-l-巖藻糖合成酶基因 fcl、整合編碼α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 bffut3bc、整合編碼α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 aspsamt。

5、優(yōu)選地，向底盤宿主基因組整合編碼使用柔性連接肽gsagsaagsgef連接的α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白基因片段。

6、優(yōu)選地，分別在敲除編碼udp-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因 wcaj和編碼腸桿菌共同抗原聚合酶基因 wzye位點(diǎn)上整合編碼磷酸甘露糖變位酶基因 manb和編碼甘露糖-1-磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶基因 manc；

7、分別在敲除編碼dtdp-4-氨基-4,6-雙脫氧-d-葡萄糖轉(zhuǎn)氨酶基因 vioa和編碼咪唑甘油磷酸合成酶基因 hisf的位點(diǎn)上整合編碼gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶基因 gmd和編碼gdp-l-巖藻糖合成酶基因 fcl；

8、分別在敲除編碼udp-n-乙酰-d-甘露糖胺糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因 wecg、編碼α-d-乙酰氨基葡萄糖-焦磷酸-多萜醇β-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因 wbbd和編碼dtdp-葡萄糖?4,6-脫水酶基因 rffg的位點(diǎn)上整合編碼α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 bffut3bc和編碼α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 aspsamt。

9、優(yōu)選地，替換編碼gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶基因 gmd的原啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子j23119。

10、優(yōu)選地，編碼α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 bffut3bc經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如sqe?id?no.1所示；編碼α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因 aspsamt經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如sqe?id?no.2所示。

11、一種二巖藻糖基乳糖的制備方法，通過對(duì)提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌培養(yǎng)并發(fā)酵得到。

12、優(yōu)選地，以甘油作為碳源，以乳糖為底物，對(duì)提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌培養(yǎng)并發(fā)酵。

13、優(yōu)選地，培養(yǎng)基包括：甘油15～20?g/l，磷酸二氫鉀10～13.5?g/l，檸檬酸1.0～2.0?g/l，磷酸氫二氨3.0～5.0?g/l，七水硫酸鎂1.0～2.0?g/l和微量金屬元素5～10?ml/l；

14、微量金屬元素中含有水硫酸鋅2.25?g/l，硫酸亞鐵10?g/l，一水硫酸錳0.35?g/l，無水硫酸銅1.0?g/l，十水硼酸鈉0.23?g/l，二水氯化鈣2.0?g/l，鉬酸銨0.11?g/l。

15、優(yōu)選地，具體步驟為：將提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體密度od600達(dá)到10時(shí)，向發(fā)酵體系中添加乳糖至10g/l，培養(yǎng)溫度設(shè)為30℃；

16、每12h向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充乳糖至10?g/l，補(bǔ)充甘油至20?g/l；維持發(fā)酵液ph值為6.8-7.2；

17、優(yōu)選地，發(fā)酵過程中設(shè)置通氣量為3-7?vvm，攪拌轉(zhuǎn)速為250-850?r/min。

18、二巖藻糖基乳糖的制備方法在制備含二巖藻糖基乳糖食品或藥品中的應(yīng)用。

19、本發(fā)明具有的優(yōu)勢和顯著成效具體體現(xiàn)在：通過精準(zhǔn)改造底盤宿主——大腸桿菌，我們成功構(gòu)建了二巖藻糖基乳糖的完整生物合成路徑；該方法的優(yōu)點(diǎn)在于無需引入外源質(zhì)粒，且在發(fā)酵流程中不需要添加抗生素，從而在保障二巖藻糖基乳糖高產(chǎn)的同時(shí)，顯著提升了最終產(chǎn)物的生物安全性；

20、搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證重組大腸桿菌可生產(chǎn)二巖藻糖基乳糖8.42?g/l，在5?l發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)中，二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量58.6?g/l，證明構(gòu)建得到的重組大腸桿菌能夠展現(xiàn)出卓越的二巖藻糖基乳糖生產(chǎn)能力，預(yù)示著其在工業(yè)化生產(chǎn)中具備廣闊的應(yīng)用潛力與良好的市場前景。