技術(shù)特征：

1.一種提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌，其特征在于：以大腸桿菌為底盤宿主，敲除編碼β半乳糖苷酶基因lacz、編碼外膜多糖輸出蛋白基因wza、敲除編碼蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶基因wzb、敲除編碼蛋白酪氨酸激酶基因wzc、敲除編碼udp-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因wcaa、敲除編碼半乳糖基轉(zhuǎn)移酶基因wcac、敲除編碼可拉酸聚合酶基因wcad、敲除編碼巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因wcae、敲除編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶基因wcaf；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌，其特征在于：向底盤宿主基因組整合編碼使用柔性連接肽gsagsaagsgef連接的α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白基因片段。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌，其特征在于：分別在敲除編碼udp-葡萄糖脂質(zhì)載體轉(zhuǎn)移酶基因wcaj和編碼腸桿菌共同抗原聚合酶基因wzye位點(diǎn)上整合編碼磷酸甘露糖變位酶基因manb和編碼甘露糖-1-磷酸鳥苷轉(zhuǎn)移酶基因manc；

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌，其特征在于：替換編碼gdp-d-甘露糖-4,6-脫水酶基因gmd的原啟動(dòng)子為強(qiáng)啟動(dòng)子j23119。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌，其特征在于：編碼α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因bffut3bc經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如sqe?idno.1所示；編碼α-1,2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因aspsamt經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核苷酸序列如sqeid?no.2所示。

6.一種二巖藻糖基乳糖的制備方法，其特征在于：通過對(duì)權(quán)利要求1-5中任一所述的提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌培養(yǎng)并發(fā)酵得到。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的二巖藻糖基乳糖的制備方法，其特征在于：以甘油作為碳源，以乳糖為底物，對(duì)提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌培養(yǎng)并發(fā)酵。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的二巖藻糖基乳糖的制備方法，其特征在于：培養(yǎng)基包括：甘油15～20?g/l，磷酸二氫鉀10～13.5?g/l，檸檬酸1.0～2.0?g/l，磷酸氫二氨3.0～5.0?g/l，七水硫酸鎂1.0～2.0?g/l和微量金屬元素5～10?ml/l；

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的二巖藻糖基乳糖的制備方法，其特征在于：具體步驟為：將提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，當(dāng)菌體密度od600達(dá)到10時(shí)，向發(fā)酵體系中添加乳糖至10g/l，培養(yǎng)溫度設(shè)為30℃；

10.權(quán)利要求6-9中任一所述的二巖藻糖基乳糖的制備方法在制備含二巖藻糖基乳糖食品或藥品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種提高二巖藻糖基乳糖產(chǎn)量的重組大腸桿菌構(gòu)建及應(yīng)用，通過將外源基因AspSAMT、BfFut3BC及二巖藻糖基乳糖合成途徑中的manB,manC,gmd,wcaG整合到宿主大腸桿菌基因組中，構(gòu)建二巖藻糖基乳糖的完整合成途徑，同時(shí)實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵酶基因的過表達(dá)和前體途徑的強(qiáng)化，通過將目的基因整合在宿主基因組上，從而達(dá)到無需外源質(zhì)粒及抗生素的添加實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)二巖藻糖基乳糖的目的。構(gòu)建得到的重組大腸桿菌能夠高效生產(chǎn)二巖藻糖基乳糖，在5?L發(fā)酵罐中，產(chǎn)量達(dá)到58.6?g/L，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：王磊,馮露,黃笛,劉斌
受保護(hù)的技術(shù)使用者：天津合生領(lǐng)航生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/2