本發(fā)明涉及外泌體制備，具體地說(shuō)，涉及一種制備外泌體的方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體以脂質(zhì)雙分子層作為保護(hù)保證了其內(nèi)含物的穩(wěn)定性，并作為一種很有前景的藥物遞送系統(tǒng)被廣泛研究。乳源外泌體在疾病診斷、治療、預(yù)防以及人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育等方面都具有重要的研究?jī)r(jià)值。其中，牛乳外泌體因其原料豐富且低廉、良好的生物相容性、安全性、低免疫原性、可口服遞送等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。牛奶樣品容易獲取，并且不會(huì)對(duì)奶牛產(chǎn)生負(fù)面影響，這為乳源外泌體的研究奠定了基礎(chǔ)。外泌體參與多種生物功能并發(fā)揮重要作用，被認(rèn)為是疾病診斷、治療和預(yù)后的重要的生物標(biāo)志物和藥物載體，因此發(fā)展簡(jiǎn)單、高效、經(jīng)濟(jì)的外泌體分離、純化、富集技術(shù)有助于疾病的早期診斷和精準(zhǔn)治療。

2、目前常用外泌體的分離方法有超速離心法、尺寸篩分的分離技術(shù)（超濾法和尺寸排阻法）、免疫親和捕獲法、試劑盒法和微流體技術(shù)等，這些分離方法得到的外泌體存在純度和/或濃度不高等問(wèn)題。離心法是最常用的方法，包括差速超速離心法和密度梯度離心法。差速超速離心法是最經(jīng)典也是使用最多的外泌體提取方法，具有成本低、獲得率高等優(yōu)勢(shì)，但是存在依賴儀器設(shè)備、耗時(shí)、容易被污染、分離純度低而且超高速離心可能破壞外泌體結(jié)構(gòu)，不適合大規(guī)模使用。密度梯度離心法與差速超速離心法相比，其獲得的外泌體純度較高，但同樣具有耗時(shí)、會(huì)破壞外泌體結(jié)構(gòu)等缺點(diǎn)。超濾法也是公認(rèn)的外泌體提取方法，具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)，但在超濾過(guò)程中存在不同超濾膜的選擇、囊泡和蛋白質(zhì)造成的濾孔堵塞、蛋白質(zhì)污染、可能損失大量外泌體等問(wèn)題。尺寸排阻法是基于分子尺寸不同的分析物在化學(xué)惰性多孔固定相孔隙中保留作用的差異實(shí)現(xiàn)分離，分離過(guò)程中外泌體損傷少、獲得的外泌體純度很高，但是不適用于從大體積液體中分離外泌體；免疫親和法利用包被單克隆抗體的磁珠結(jié)合外泌體，可用于外泌體某一亞群的提取，特異性較高，但操作耗時(shí)、提取效率低、成本高、產(chǎn)出少，且不適用于大量樣本，并且，抗體與外泌體一旦結(jié)合很難在溫和的洗脫條件下進(jìn)行分離。商用外泌體分離純化試劑盒因操作簡(jiǎn)單、節(jié)省時(shí)間而受到越來(lái)越多的關(guān)注，大多商用試劑盒使用聚合物共沉淀方法富集外泌體，但商用試劑盒分離出的外泌體純度較低，而且其中的聚合物難以去除，對(duì)后續(xù)的分析造成不良影響。微流體技術(shù)產(chǎn)量低、純度低，存在耗時(shí)和流程難以標(biāo)準(zhǔn)化及大規(guī)模試驗(yàn)等問(wèn)題。

3、此外，人工抗體材料用于外泌體相關(guān)的研究剛剛起步，由于外泌體復(fù)雜多樣的表面結(jié)構(gòu)，人工抗體與外泌體識(shí)別的分子機(jī)制尚未清楚闡明，且外泌體通用型配基種類少，特異性配基研發(fā)過(guò)程專業(yè)性強(qiáng)，因此鮮有應(yīng)用于外泌體分離純化的人工抗體的報(bào)道。

4、外泌體的分離和分析有望取代傳統(tǒng)的侵入性體液采集模式(如血液、尿液和腦脊液等)?，用作疾病早期檢測(cè)的生物標(biāo)志物。同時(shí)，外泌體不僅本身就是治療劑，而且還是靶向藥物遞送和治療的載體。因此，作為闡明病理生理機(jī)制和臨床診療的重要一環(huán)，需不斷深入研究外泌體的分子特征、生物功能以及臨床應(yīng)用等，進(jìn)而對(duì)外泌體的分離純化技術(shù)提出了更高的要求。但是體液環(huán)境復(fù)雜，外泌體濃度低，加之自身體積小，為滿足科研和臨床的需求，實(shí)現(xiàn)外泌體快速、高效、高純度、無(wú)損耗的分離純化已成為外泌體研究領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種可高效從乳源中分離獲得高純度、高收率的外泌體的方法。

2、本發(fā)明提供了一種制備外泌體的方法，以動(dòng)物乳為原料進(jìn)行外泌體的制備，其包括：

3、（1）等電點(diǎn)沉淀分離：

4、將脫脂后的動(dòng)物乳，以醋酸-醋酸鈉溶液調(diào)節(jié)ph值至4.5-4.6，充分酸沉完畢后，去除沉淀分離獲得乳清液；所述醋酸-醋酸鈉溶液中醋酸和醋酸鈉的摩爾比為1：（1.4-1.8），醋酸根離子的濃度為0.055-0.075mol/l（優(yōu)選0.056-0.071mol/l）；

5、（2）微濾：將所述乳清液進(jìn)行微濾，去除雜質(zhì)，獲得透過(guò)液；

6、（3）超濾：將所述透過(guò)液以nacl水溶液進(jìn)行洗濾，獲得外泌體截留液；所述外泌體截留液中蛋白質(zhì)含量低于2μg/ml，滲透壓為280-310mosm/l；

7、（4）循環(huán)式自由流等電聚焦電泳：將所述外泌體截留液與載體兩性電解質(zhì)溶液進(jìn)行混合獲得電泳液進(jìn)行電泳，收集ph值為4-7的組分；所述載體兩性電解質(zhì)溶液為醋酸-醋酸鈉溶液；所述電泳液中外泌體的濃度為1.5×108-1×1010粒/ml，醋酸根離子和鈉離子的摩爾比為1：（0.3-0.55），醋酸根離子的濃度為0.02-0.029mol/l。

8、優(yōu)選，本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（1）中，所述醋酸-醋酸鈉溶液中醋酸和醋酸鈉的摩爾比為1：（1.6-1.62），更優(yōu)選為1：0.617，醋酸根離子的濃度為0.065mol/l；

9、和/或，步驟（4）中，所述電泳液中外泌體的濃度為2.5×109粒/ml，醋酸根離子和鈉離子的摩爾比為1：（0.42-0.43），優(yōu)選為1：0.423，醋酸根離子的濃度為0.025-0.026mol/l，優(yōu)選為0.02567mol/l。

10、本發(fā)明在分離動(dòng)物乳中的外泌體時(shí)，大致是先通過(guò)特定的酸沉法去除動(dòng)物乳中的酪蛋白，之后再通過(guò)微濾去除較大的顆粒和雜質(zhì)（如，細(xì)菌、部分乳脂肪球及較大的懸浮顆粒），接著通過(guò)特定超濾對(duì)除外泌體外的成分進(jìn)行進(jìn)一步去除（如，乳清蛋白），以獲得的超濾截留液與特定載體兩性電解質(zhì)溶液混合后進(jìn)行循環(huán)式自由流等電聚焦電泳。

11、具體地，本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)行酪蛋白酸沉?xí)r，使用本領(lǐng)域的常規(guī)方法，雖可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的去除，但不利于保證外泌體的結(jié)構(gòu)完整性，從而即便配合循環(huán)式自由流等電聚焦電泳，仍無(wú)法獲得理想的收率，當(dāng)改以本發(fā)明特定的醋酸-醋酸鈉溶液進(jìn)行ph值調(diào)節(jié)后，既可兼顧酪蛋白的有效去除，又可提升最終外泌體的回收率。

12、此外，本發(fā)明還研究發(fā)現(xiàn)，在去除雜質(zhì)時(shí)，先通過(guò)微濾去除大尺寸雜質(zhì)后，若以常規(guī)的水進(jìn)行超濾洗濾，雖可去除小尺寸雜質(zhì)，但也不利于保證外泌體結(jié)構(gòu)的完整性。而改以本發(fā)明的nacl水溶液進(jìn)行洗濾，最終對(duì)截留液的滲透壓和蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行特定控制后，既可保證雜質(zhì)的盡量減少，又可避免引入過(guò)多的離子，兼顧外泌體結(jié)構(gòu)的保持和后續(xù)進(jìn)行循環(huán)式自由流等電聚焦電泳的需求。

13、再者，本發(fā)明在進(jìn)行循環(huán)式自由流等電聚焦電泳時(shí)，特別選用醋酸-醋酸鈉溶液作為載體兩性電解質(zhì)溶液，并對(duì)電泳液中的主要物質(zhì)濃度進(jìn)行了控制，從而既不額外引入其它離子，又保證了電泳時(shí)外泌體的有效分離，進(jìn)而可獲得純度高、收率佳的效果。若各主要物質(zhì)濃度的配合不佳，則無(wú)法在電泳介質(zhì)中形成有效的ph梯度或?qū)ν饷隗w的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。這將導(dǎo)致無(wú)法獲得有效的純化結(jié)果。

14、本發(fā)明中，動(dòng)物乳為牛乳、羊乳、駝乳、鹿乳、馬乳等哺乳動(dòng)物的乳汁。

15、本發(fā)明的動(dòng)物乳可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行脫脂，如在溫度45-50℃（優(yōu)選45℃），以轉(zhuǎn)速3500-5500轉(zhuǎn)/min（優(yōu)選4500轉(zhuǎn)/min）進(jìn)行離心。

16、本發(fā)明動(dòng)物乳在進(jìn)行脫脂前優(yōu)選進(jìn)行常規(guī)的凈乳操作，如，以離心凈乳機(jī)，在溫度1-10℃（優(yōu)選4-7℃），轉(zhuǎn)速3500-5500轉(zhuǎn)/min下離心10-20分鐘。

17、本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（2）中，所述微濾時(shí)，微濾膜的孔徑為0.6~1.0μm，溫度為4-7℃，壓力為2-6bar。

18、本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（3）中，所述超濾時(shí)，超濾膜的孔徑為200-400kda，溫度為4-7℃，壓力為0.05～0.2mpa；

19、以本發(fā)明的微濾和超濾條件進(jìn)行處理，有利于保證最終外泌體的純度和回收率（降低對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)的影響）。若微濾和超濾時(shí)的溫度過(guò)高，或者微濾和超濾壓力、孔徑配合不佳，均會(huì)降低外泌體的純度和/或回收率。因此，優(yōu)選使用本發(fā)明的上述處理?xiàng)l件。

20、本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（3）中，所述nacl水溶液中nacl的濃度為0.8%-1%。

21、本發(fā)明中，以nacl水溶液進(jìn)行洗濾時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)對(duì)nacl水溶液的濃度和用量進(jìn)行調(diào)整，以同時(shí)將截留液的滲透壓和蛋白質(zhì)濃度控制到本發(fā)明的限定為準(zhǔn)。例如，若nacl水溶液的濃度較高，則可適當(dāng)減少nacl水溶液的用量，在控制蛋白質(zhì)濃度的同時(shí)，避免滲透壓過(guò)大；若nacl水溶液的濃度較低，則可適當(dāng)增加nacl水溶液的用量，以在滲透壓適宜的前提下，更充分地洗去雜質(zhì)。

22、更優(yōu)選，本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（2）中，所述微濾時(shí)，微濾膜的孔徑為0.8μm，溫度為6℃，壓力為4?bar；

23、和/或，步驟（3）中，所述超濾時(shí)，超濾膜的孔徑為300kda，溫度為6℃，壓力為0.1mpa；所述nacl水溶液中nacl的濃度為0.9%。

24、本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（4）中，循環(huán)式自由流等電聚焦電泳的壓力為300-500v，聚焦期間分離腔的溫度為2-8℃。

25、優(yōu)選，本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（4）中，循環(huán)式自由流等電聚焦電泳的壓力為400v，溫度為4℃。

26、溫度對(duì)于外泌體的結(jié)構(gòu)有所影響，且也會(huì)影響兩性電解質(zhì)的解離程度和緩沖能力，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)進(jìn)行選用，優(yōu)選使用本發(fā)明的循環(huán)式自由流等電聚焦電泳條件，其可很好地與特定電泳液配合，實(shí)現(xiàn)理想的外泌體分離效果。

27、本發(fā)明的電泳中，通過(guò)陽(yáng)極電解液和陰極電解液的不斷循環(huán)流動(dòng)來(lái)提供并維持穩(wěn)定的電泳電壓，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)常識(shí)進(jìn)行陽(yáng)極電解液和陰極電解液的選擇，以及電泳液和陽(yáng)極電解液、陰極電解液的循環(huán)泵速，以保證電泳可實(shí)現(xiàn)為準(zhǔn)（如，將電泳液的循環(huán)泵速設(shè)置為1-3?ml/min，將陽(yáng)極電解液、陰極電解液的循環(huán)泵速設(shè)置為2-4?ml/min，設(shè)置電泳液的循環(huán)泵速低于陽(yáng)極電解液、陰極電解液的循環(huán)泵速）。

28、本發(fā)明的循環(huán)式自由流等電聚焦電泳終點(diǎn)的判斷方法為本領(lǐng)域常識(shí)，即當(dāng)電流下降到1-5ma，30min內(nèi)變動(dòng)在±1ma時(shí)，說(shuō)明等電聚焦已完成，可進(jìn)行目標(biāo)物收集。

29、本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（1）中，脫脂后的動(dòng)物乳中脂肪的含量≤0.05%，有利于后續(xù)電泳的進(jìn)行。

30、本發(fā)明制備外泌體的方法的步驟（1）中，通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)離心方法去除沉淀分離獲得乳清液；優(yōu)選，所述離心的溫度為0-6℃，更優(yōu)選為4℃，轉(zhuǎn)速為8000-15000轉(zhuǎn)/min，更優(yōu)選為10000轉(zhuǎn)/min。

31、本發(fā)明還提供上述制備外泌體的方法在提升以乳源進(jìn)行外泌體分離時(shí)，外泌體的純度中的應(yīng)用。

32、本發(fā)明還提供上述制備外泌體的方法在提升以乳源進(jìn)行外泌體分離時(shí)，外泌體的回收率中的應(yīng)用。

33、本發(fā)明的有益效果至少在于：

34、本發(fā)明的方法可大規(guī)模處理原料，適用于動(dòng)物乳中外泌體的工業(yè)化富集，整個(gè)方法回收率高（在70%以上），獲得的外泌體純度高（80-99%），能夠降低外泌體的生產(chǎn)成本。