一種黃精多糖的柱層析分離方法和提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明具體的涉及一種黃精多糖的柱層析分離方法和提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]黃精是臨床常用中藥之一，其主要活性成分是黃精多糖。黃精多糖對(duì)人體發(fā)揮著多種有益的生理調(diào)節(jié)作用:其具有的抗腫瘤作用，可以有效地抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展；具有的抗衰老作用，可作為人體一種有效的抗衰老制劑使用；具有的免疫調(diào)節(jié)作用，可以有效地增強(qiáng)免疫細(xì)胞的免疫功能；此外還具有抗菌、抗動(dòng)脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)血糖血脂等作用(何才通，李文.黃精多糖藥理功效研宄進(jìn)展.新中醫(yī)，2014，46 (3):196-199)。因此，黃精多糖對(duì)人體具有多種免疫活性，對(duì)改善機(jī)體免疫功能，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞微環(huán)境，增加外周血細(xì)胞及骨髓造血干細(xì)胞數(shù)量等方面有著卓越的功效。
[0003]文獻(xiàn)[黃精低聚糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析，衛(wèi)冰，許閩，于雷，楊云，《中成藥》，2012年4月，第34卷第4期，694-697頁(yè)]中，作者采用多次柱層析分離純化獲得黃精低聚糖，用水洗脫，步驟繁瑣，增加了成本消耗，且僅分離純化出了黃精低聚糖(平均分子量為1741Da)，對(duì)于黃精中分子量更高的多糖的分離純化并不適用。
[0004]文獻(xiàn)[大孔吸附樹(shù)脂純化黃精小分子糖的工藝研宄，李曉坤，董晶晶，賀海花，楊云，《中國(guó)藥師》，2011年04期，454-457頁(yè)]中公開(kāi)了采用大孔吸附樹(shù)脂純化黃精小分子糖的工藝，其中洗脫劑為蒸餾水，但是其純化的對(duì)象仍然是局限于黃精小分子糖，對(duì)于黃精中分子量更高的多糖的分離純化并不適用。
[0005]文獻(xiàn)[黃精中三萜皂苷和活性多糖的分離與鑒定，王彩霞，江南大學(xué)，2008年，碩士學(xué)位論文]中公開(kāi)了采用大孔吸附樹(shù)脂純化黃精多糖的工藝，但是其明確記載大孔吸附樹(shù)脂對(duì)多糖不吸附，可用去離子水直接洗脫下來(lái)，但是純化效果較差，作者后續(xù)又采用了其他分離方法對(duì)多糖進(jìn)行了進(jìn)一步的純化，依然是存在步驟繁瑣，增加了成本消耗的缺陷。
[0006]雖然上述三篇文獻(xiàn)中均采用了水做洗脫劑，在大孔吸附樹(shù)脂柱上對(duì)黃精多糖進(jìn)行分離和純化，但是，黃精中的雜質(zhì)有一大部分會(huì)溶解在水中，隨著水的洗脫而和多糖一起被洗脫下來(lái)，對(duì)黃精多糖的純化是不利的，只能用來(lái)粗略的純化黃精多糖。
[0007]因此，本領(lǐng)域亟需開(kāi)發(fā)一種能夠利用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)黃精多糖進(jìn)行分離純化的方法，且該方法適用的多糖分子量范圍較寬，不僅能夠用來(lái)分離低聚糖，更能適用于分離分子量較大的黃精多糖，且純化、除雜效果更好，使黃精多糖的利用率及純度均得到提高，更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中黃精多糖的提取工藝和純化工藝的產(chǎn)物純度不高，及僅能提取黃精多糖中的小分子糖(或低聚糖)，種類單一，而不能純化出多糖分子量范圍較寬的黃精多糖，使黃精多糖的利用率低的缺陷，或者由于僅采用水進(jìn)行洗脫而使除雜、純化效果較差，往往需聯(lián)合其他分離方法進(jìn)行后續(xù)的進(jìn)一步的純化，步驟繁瑣，增加成本消耗等缺陷，而提供了一種黃精多糖的柱層析分離方法和提取方法。本發(fā)明的黃精多糖的柱層析分離方法和提取方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，產(chǎn)物純度高，該方法適用的多糖分子量范圍較寬，不僅能夠用來(lái)分離低聚糖，更能適用于分離分子量較大的黃精多糖，且純化、除雜效果更好，使黃精多糖的利用率及純度均得到提高，更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0009]本發(fā)明提供了一種黃精多糖的柱層析分離方法，其包括如下步驟:將黃精多糖粗品用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行柱層析分離，即可；其中，上樣量為每100?200毫升柱體積上樣10毫升，且上樣的藥液中黃精多糖的濃度為3.5?4.5毫克/毫升；洗脫劑為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10?50%的乙醇水溶液；洗脫劑的用量為每100?200毫升柱體積用洗脫劑80?150毫升；洗脫流速為I?2毫升/分鐘；所述的大孔吸附樹(shù)脂的參數(shù)如下:粒徑為0.3?1.25mm，孔徑為13?30nm，樹(shù)脂骨架為聚苯乙烯-二乙烯苯。
[0010]較佳地，所述的大孔吸附樹(shù)脂為極性大孔吸附樹(shù)脂和/或非極性大孔吸附樹(shù)脂。
[0011]所述的極性大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)選NKA-9樹(shù)脂和/或AB-8樹(shù)脂。
[0012]所述的非極性大孔吸附樹(shù)脂優(yōu)選X-5樹(shù)脂。
[0013]所述的上樣量?jī)?yōu)選每150?200 _升柱體積上樣10暈升，更優(yōu)選每150?160暈升柱體積上樣10 _升。
[0014]所述的上樣的藥液中黃精多糖的濃度優(yōu)選3.5?4.0毫克/毫升，更優(yōu)選3.9?
4.0暈克/暈升。
[0015]所述的柱層析分離的上樣流速優(yōu)選I?2毫升/分鐘；更優(yōu)選1.5?2毫升/分鐘。
[0016]所述的柱層析分離在上樣后優(yōu)選還進(jìn)行靜置。所述的靜置的時(shí)間優(yōu)選10?14小時(shí)，更優(yōu)選12?14小時(shí)。
[0017]所述的大孔吸附樹(shù)脂在進(jìn)行柱層析分離時(shí)，其柱子的長(zhǎng)度優(yōu)選30?100厘米；更優(yōu)選50?80厘米。
[0018]所述的大孔吸附樹(shù)脂在進(jìn)行柱層析分離時(shí)，柱子的直徑優(yōu)選I?5厘米；更優(yōu)選2?3厘米。
[0019]所述的洗脫劑的種類優(yōu)選乙醇的質(zhì)量百分比為20%?50%的乙醇水溶液，更優(yōu)選乙醇的質(zhì)量百分比為30%?50%的乙醇水溶液。
[0020]所述的洗脫劑的用量?jī)?yōu)選每100?200暈升柱體積用洗脫劑100?120暈升，更優(yōu)選每100?200暈升柱體積用洗脫劑110?120暈升。
[0021]所述的黃精多糖的柱層析分離方法的裝柱的方法優(yōu)選是用水進(jìn)行濕法裝柱。所述的濕法裝柱的水優(yōu)選超純水。
[0022]所述的裝柱在進(jìn)行前，優(yōu)選還進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理。所述的預(yù)處理優(yōu)選包括如下步驟:先將大孔吸附樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡24?48小時(shí)，然后用水進(jìn)行濕法裝柱，然后用無(wú)水乙醇沖洗樹(shù)脂柱，至流出液加兩倍體積蒸餾水不產(chǎn)生渾濁時(shí)，再用水沖洗樹(shù)脂柱至無(wú)醇味；然后倒出柱中的樹(shù)脂，10?30°C下真空干燥，即可。
[0023]所述的預(yù)處理中的水優(yōu)選超純水。
[0024]較佳地，所述的黃精多糖的柱層析分離方法，還進(jìn)一步包括所述的黃精多糖粗品的提取方法，其包括如下步驟:將生黃精藥材與水混合，加熱至沸騰并保持微沸或小火煮沸30?90分鐘后，將黃精藥材和煎出液分開(kāi)，然后將分出的黃精藥材再與另外的水混合，重復(fù)上述加熱煮沸并分離黃精藥材和煎出液的過(guò)程I?3次，合并所有煎出液，濃縮，制得所述的黃精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黃精多糖粗品；每次與黃精藥材混合的水的質(zhì)量為所述的生黃精藥材的質(zhì)量的6?14倍。
[0025]所述的每次與黃精藥材混合的水的質(zhì)量?jī)?yōu)選是所述的生黃精藥材的質(zhì)量的7?12倍，更優(yōu)選是所述的生黃精藥材的質(zhì)量的8?10倍。
[0026]所述的保持微沸或小火煮沸的時(shí)間優(yōu)選60?90分鐘。
[0027]所述的重復(fù)上述加熱煮沸并分離黃精藥材和煎出液的過(guò)程的次數(shù)優(yōu)選2?3次，更優(yōu)選3次。
[0028]較佳地，所述的濃縮的標(biāo)準(zhǔn)是將合并后煎出液中的水除去一部分，使?jié)饪s后煎出液中藥液比為1: (0.5?I)，更優(yōu)選為1:1 ;所述的藥液比為“所述的生黃精藥材的質(zhì)量”:“所述的黃精多糖粗品的提取液的體積”，單位為克/毫升。
[0029]較佳地，所述的濃縮的方法為煮沸使?jié)饪s的方法；更佳地為大火煮沸使?jié)饪s。
[0030]較佳地，所述的“醇沉”的操作為:將所述的黃精多糖粗品的提取液與乙醇的質(zhì)量百分比為90 %?95%的乙醇水溶液混合均勻，形成混合液，所述的混合液中乙醇的質(zhì)量百分比為75%?85%，在10?35°C的條件下靜置12?24小時(shí)，然后過(guò)濾，制得所述的黃精多糖粗品。
[0031 ] 較佳地，所述的混合均勻的方法為攪拌的方法。
[0032]較佳地，所述的混合液中乙醇的質(zhì)量百分比為75%?80%。
[0033]本發(fā)明還提供了一種黃精多糖粗品的提取方法，其包括如下步驟:將生黃精藥材與水混合，加熱至沸騰并保持煮沸30?90分鐘后，將黃精藥材和煎出液分開(kāi)，然后將分出的黃精藥材再與另外的水混合，重復(fù)上述加熱煮沸并分離黃精藥材和煎出液的過(guò)程I?3次，合并所有煎出液，濃縮，制得所述的黃精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黃精多糖粗品；每次與黃精藥材混合的水的質(zhì)量為所述的生黃精藥材的質(zhì)量的6?14倍。
[0034]所述的黃精多糖粗品的提取方法的方法和條件同前所述。
[0035]在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。
[0036]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0037]本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于:本發(fā)明的黃精多糖的柱層析分離方法和提取方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，產(chǎn)物純度高，該方法適用的多糖分子量范圍較寬，不僅能夠用來(lái)分離低聚糖，更能適用于分離分子量較大的黃精多糖，且純化、除雜效果更好，使黃精多糖的利用率及純度均得到提高，更加適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0038]圖1為實(shí)施例3中黃精多糖的紫外吸收光譜，其中，625nm為黃精多糖的最大吸收波長(zhǎng)
[0039]圖2為實(shí)施例3中葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為y = 0.0057x+0.0264，線性相關(guān)系數(shù)r = 0.9991，線性范圍是橫坐標(biāo)的數(shù)值為21.79?108.96 μ g。
【具體實(shí)施方式】
[0040]下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書(shū)選擇。
[0041]以下實(shí)施例中所述的常溫或室溫均指環(huán)境溫度為10?30°C。
[0042]以下實(shí)施例，均是在常壓下進(jìn)行。
[0043]以下實(shí)施例中，黃精多糖的純度是指經(jīng)過(guò)柱層析分離之后所得的產(chǎn)品中，黃精多糖的質(zhì)量占產(chǎn)品總質(zhì)量的質(zhì)量百分比。
[0044]實(shí)施例1黃精多糖的提取
[0045]將I克生黃精藥材與8克水混合，加熱至沸騰并保持煮沸60分鐘后，將黃精藥材和煎出液分開(kāi)，然后將分出的黃精藥材再與另外8克的水混合，然后重復(fù)上述加熱煮沸并分離黃精藥材和煎出液的過(guò)程2次，合并所有煎出液。
[0046]將合并后的煎出液大火煮沸進(jìn)行濃縮，使藥液比為1:1時(shí)，停止?jié)饪s。
[0047]將濃縮后的藥液中添加乙醇的質(zhì)量百分比為95%的乙醇水溶液，使添加后混合液中乙醇的質(zhì)量百分比為75%，(加乙醇水溶液時(shí)慢加快攪有助于防止共沉淀的發(fā)生)，攪拌均勻后，在常溫的條件下靜置12小時(shí)，然后過(guò)濾，得沉淀為黃精多糖粗品。
[0048]所得沉淀中黃精多糖的純度為70%。這里黃精多糖的純度測(cè)定的方法是采用實(shí)施例5中的方法。
[0049]實(shí)施例2樹(shù)脂預(yù)處理
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