50]取AB-8 (極性)、X-5 (非極性)以及NKA-9 (極性)這3種樹(shù)脂各2.0克，分別用無(wú)水乙醇浸泡24小時(shí)，(乙醇的量以能完全浸沒(méi)樹(shù)脂為準(zhǔn))，然后用超純水濕法裝柱；用無(wú)水乙醇沖洗樹(shù)脂柱，至流出液加2倍體積蒸餾水不產(chǎn)生渾濁，再用超純水沖洗樹(shù)脂柱至無(wú)醇味。然后各樹(shù)脂在室溫下真空干燥，備用。
[0051 ] 實(shí)施例3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制
[0052]1、黃精多糖的最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定參考文獻(xiàn)[Imbety, Bourne Y, Cambillau Cet al，Oligosaccharide Conformat1n in Protein Carbohydrate Computers, Adv.B1phyS，Chem，1993，3:71?117.]或[楊莉，王志華，陶健生等.黃芪中黃芪多糖含量測(cè)定方法的比較[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2005，36(9):562-563]的方法進(jìn)行，并得到黃精多糖的紫外吸收光譜，見(jiàn)圖1，其中，625nm為最大吸收波長(zhǎng)。
[0053]本發(fā)明中以下實(shí)施例中糖的含量的測(cè)定均在此波長(zhǎng)下進(jìn)行。
[0054]2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的配制
[0055]精密稱(chēng)取干燥至恒定的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品適量，加超純水定溶于10mL容量瓶中，使其濃度為0.1 lmg/ml，即可。
[0056]3、0.2%硫酸一蒽酮溶液的配制
[0057]精密稱(chēng)取蒽酮0.2g,用10ml 95%濃硫酸溶解，慢加快攪，直至蒽酮完全溶解)，即得0.2%蒽酮-濃硫酸溶液，備用。
[0058]4、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)
[0059]分別精密移取濃度為0.227mg/mL的葡萄糖(單糖)標(biāo)準(zhǔn)液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、l.0mL于試管中，分別加入純水至2mL，然后分別精密緩慢加入0.2%蒽酮-濃硫酸溶液4mL，振搖混勾，靜止I小時(shí)，另以未加葡萄糖的溶液為空白，于625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ao以A為縱坐標(biāo)，溶液中葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，見(jiàn)圖2，該標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的方程為y = 0.0057X+0.026，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r = 0.9991，線(xiàn)性范圍是溶液中葡萄糖質(zhì)量為21.79?108.96 μ g。
[0060]本發(fā)明中以下實(shí)施例中的黃精多糖的含量均在此標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上進(jìn)行推算。
[0061]實(shí)施例4黃精多糖的純化
[0062]用NKA-9大孔吸附樹(shù)脂為填料，先進(jìn)行實(shí)施例2中的預(yù)處理，然后將預(yù)處理后的樹(shù)脂2.0g用超純水進(jìn)行濕法裝柱。柱長(zhǎng)度為50cm，柱直徑為2cm。
[0063]將經(jīng)過(guò)實(shí)施例1的方法獲得的黃精多糖粗品用超純水配制成濃度為3.90mg/mL的粗黃精多糖的藥液，取其中1mL進(jìn)行上樣，上樣流速為2mL/min ;上樣后靜置時(shí)間為12小時(shí)；然后用洗脫劑為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為30%的乙醇水溶液進(jìn)行洗脫；洗脫劑的用量為120mL ;洗脫流速為2mL/min。用稱(chēng)重后的干凈的玻璃杯收集流出的全部洗脫液。
[0064]實(shí)施例5黃精多糖含量的測(cè)定
[0065]將實(shí)施例4中收集的洗脫液在水浴鍋上進(jìn)行加熱煮干，煮到只剩玻璃杯上沾附的藥材固體。稱(chēng)重后減去玻璃杯凈重，得黃精多糖質(zhì)量。
[0066]將所述的玻璃杯上沾附的藥材固體用100毫升超純水溶解定容。取其中0.2毫升加超純水至2mL，精密緩慢加入0.2 %蒽酮-濃硫酸溶液4mL，振搖混勻，靜止I小時(shí)，于625nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，減去不含多糖的0.2%蒽酮-濃硫酸溶液空白樣的吸光度，得到黃精多糖的吸光度。在圖2的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上找到對(duì)應(yīng)的多糖的質(zhì)量。
[0067]另取樣品和柱子將實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)操作再重復(fù)5次，每次的上樣樣品是互不相關(guān)的，每次的柱子也是互不相關(guān)的。
[0068]這6次所得產(chǎn)品進(jìn)行上述的水浴干燥后稱(chēng)量，黃精多糖質(zhì)量?jī)糁胤謩e為33.9mg、33.lmg、34.9mg、33.9mg、33.6mg和32.9mg，分別進(jìn)行上述的用100毫升超純水溶解定容后，濃度分別為:0.339mg/ml、0.331mg/ml、0.349mg/ml、0.339mg/ml、0.336mg/ml 和 0.329mg/ml，分別取各自的0.2ml進(jìn)行純度檢測(cè)，經(jīng)測(cè)定其多糖質(zhì)量分別為56.38 μ g,55.19 μ g、58.211^、56.641^、55.98 1^及54.83 1^;黃精多糖的純度(質(zhì)量百分比)分別為83.2%、83.4%、83.4%、83.5%、83.3%及83.3%。這六次的黃精多糖純度的平均值為83.35%。
[0069]可見(jiàn)，本發(fā)明的黃精多糖的純化方法重復(fù)性非常好，所得黃精多糖純度也較高。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于，其包括如下步驟:將黃精多糖粗品用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行柱層析分離，即可；其中，上樣量為每100?200毫升柱體積上樣10毫升，且上樣的藥液中黃精多糖的濃度為3.5?4.5毫克/毫升；洗脫劑為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10?50%的乙醇水溶液；洗脫劑的用量為每100?200毫升柱體積用洗脫劑80?150毫升；洗脫流速為I?2毫升/分鐘；所述的大孔吸附樹(shù)脂的參數(shù)如下:粒徑為0.3?1.25mm，孔徑為13?30nm，樹(shù)脂骨架為聚苯乙烯-二乙烯苯。
2.如權(quán)利要求1所述的黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于: 所述的大孔吸附樹(shù)脂為極性大孔吸附樹(shù)脂和/或非極性大孔吸附樹(shù)脂； 和/或，所述的上樣量為每150?200 _升柱體積上樣10暈升； 和/或，所述的上樣的藥液中黃精多糖的濃度為3.5?4.0毫克/毫升； 和/或，所述的柱層析分離的上樣流速為I?2毫升/分鐘； 和/或，所述的柱層析分離在上樣后還進(jìn)行靜置； 和/或，所述的大孔吸附樹(shù)脂在進(jìn)行柱層析分離時(shí)，其柱子的長(zhǎng)度為30?100厘米； 和/或，所述的大孔吸附樹(shù)脂在進(jìn)行柱層析分離時(shí)，柱子的直徑為I?5厘米； 和/或，所述的黃精多糖的柱層析分離方法的裝柱的方法是用水進(jìn)行濕法裝柱； 和/或，所述的裝柱在進(jìn)行前，還進(jìn)行大孔吸附樹(shù)脂的預(yù)處理；所述的預(yù)處理包括如下步驟:先將大孔吸附樹(shù)脂用無(wú)水乙醇浸泡24?48小時(shí)，然后用水進(jìn)行濕法裝柱，然后用無(wú)水乙醇沖洗樹(shù)脂柱，至流出液加兩倍體積蒸餾水不產(chǎn)生渾濁時(shí)，再用水沖洗樹(shù)脂柱至無(wú)醇味；然后倒出柱中的樹(shù)脂，10?30°C下真空干燥，即可。
3.如權(quán)利要求2所述的黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于: 所述的極性大孔吸附樹(shù)脂為NKA-9樹(shù)脂和/或AB-8樹(shù)脂； 和/或，所述的非極性大孔吸附樹(shù)脂為X-5樹(shù)脂； 和/或，所述的上樣量為每150?160 _升柱體積上樣10暈升； 和/或，所述的上樣的藥液中黃精多糖的濃度為3.9?4.0毫克/毫升； 和/或，所述的柱層析分離的上樣流速為1.5?2毫升/分鐘； 和/或，所述的靜置的時(shí)間為10?14小時(shí)； 和/或，所述的大孔吸附樹(shù)脂在進(jìn)行柱層析分離時(shí)，其柱子的長(zhǎng)度為50?80厘米； 和/或，所述的大孔吸附樹(shù)脂在進(jìn)行柱層析分離時(shí)，柱子的直徑為2?3厘米。
4.如權(quán)利要求1所述的黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于: 所述的洗脫劑的種類(lèi)為乙醇的質(zhì)量百分比為20%?50%的乙醇水溶液； 和/或，所述的洗脫劑的用量為每100?200毫升柱體積用洗脫劑100?120毫升。
5.如權(quán)利要求4所述的黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于: 所述的洗脫劑的種類(lèi)為乙醇的質(zhì)量百分比為30%?50%的乙醇水溶液； 和/或，所述的洗脫劑的用量為每100?200毫升柱體積用洗脫劑110?120毫升。
6.如權(quán)利要求1所述的黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于:所述的黃精多糖的柱層析分離方法，還進(jìn)一步包括所述的黃精多糖粗品的提取方法，其包括如下步驟:將生黃精藥材與水混合，加熱至沸騰并保持微沸或小火煮沸30?90分鐘后，將黃精藥材和煎出液分開(kāi)，然后將分出的黃精藥材再與另外的水混合，重復(fù)上述加熱煮沸并分離黃精藥材和煎出液的過(guò)程I?3次，合并所有煎出液，濃縮，制得所述的黃精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黃精多糖粗品；每次與黃精藥材混合的水的質(zhì)量為所述的生黃精藥材的質(zhì)量的6?14倍。
7.如權(quán)利要求6所述的黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于: 所述的每次與黃精藥材混合的水的質(zhì)量是所述的生黃精藥材的質(zhì)量的7?12倍； 和/或，所述的保持微沸或小火煮沸的時(shí)間是60?90分鐘； 和/或，所述的重復(fù)上述加熱煮沸并分離黃精藥材和煎出液的過(guò)程的次數(shù)為2?3次； 和/或，所述的濃縮的標(biāo)準(zhǔn)是將合并后煎出液中的水除去一部分，使?jié)饪s后煎出液中藥液比為1: (0.5?I)，所述的藥液比為“所述的生黃精藥材的質(zhì)量”所述的黃精多糖粗品的提取液的體積”，單位為克/毫升； 和/或，所述的濃縮的方法為煮沸使?jié)饪s的方法。
8.如權(quán)利要求7所述的黃精多糖的柱層析分離方法，其特征在于: 所述的“醇沉”的操作為:將濃縮后的藥液與乙醇的質(zhì)量百分比為90%?95%的乙醇水溶液混合均勻，形成混合液，所述的混合液中乙醇的質(zhì)量百分比為75%?85%，在10?35°C的條件下靜置12?24小時(shí)，然后過(guò)濾，制得所述的黃精多糖粗品。
9.一種黃精多糖粗品的提取方法，其特征在于，其包括如下步驟:將生黃精藥材與水混合，加熱至沸騰并保持煮沸30?90分鐘后，將黃精藥材和煎出液分開(kāi)，然后將分出的黃精藥材再與另外的水混合，重復(fù)上述加熱煮沸并分離黃精藥材和煎出液的過(guò)程I?3次，合并所有煎出液，濃縮，制得所述的黃精多糖粗品的提取液；然后，醇沉，制得所述的黃精多糖粗品；每次與黃精藥材混合的水的質(zhì)量為所述的生黃精藥材的質(zhì)量的6?14倍；所述的黃精多糖粗品的提取方法的方法和條件同權(quán)利要求6?8中任一項(xiàng)所述。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種黃精多糖的柱層析分離方法和提取方法。本發(fā)明的黃精多糖的柱層析分離方法，其包括如下步驟：將黃精多糖用大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行柱層析分離，即可；其中，上樣量為每100～200毫升柱體積上樣10毫升，且上樣的藥液中黃精多糖的濃度為3.5～4.5毫克/毫升；洗脫劑為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為10～50％的乙醇水溶液；洗脫劑的用量為每100～200毫升柱體積用洗脫劑80～150毫升；洗脫流速為1～2毫升/分鐘。本發(fā)明的黃精多糖的柱層析分離方法和提取方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，產(chǎn)物純度高，所分離的黃精多糖種類(lèi)多樣，并不局限低聚糖，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類(lèi)】C08B37-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104530253
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510056976
【發(fā)明人】王立芳, 毛泉明, 徐振曄, 張寧, 高嵩, 司海龍, 王鶴潼
【申請(qǐng)人】上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年2月3日