一種假絲酵母蛋白酶制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用微生物液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)假絲酵 母蛋白酶制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，蛋白酶廣泛應(yīng)用于洗滌劑、飼料、食品工業(yè)、 釀酒釀造、制革工業(yè)以及醫(yī)藥領(lǐng)域中；除此之外，蛋白酶還是用途最廣泛的酶制劑之一，應(yīng) 用于洗滌劑、制革、毛皮、蛋白水解物、釀酒、醬油、紡織、醫(yī)藥品、化妝品等的生產(chǎn)和生物材 料的提取上。蛋白酶的廣泛應(yīng)用，不僅簡化了行業(yè)的生產(chǎn)工藝、節(jié)約成本、提高產(chǎn)品得率，而 且對改善環(huán)境，減少二氧化碳排放也做出了積極貢獻(xiàn)。近年來隨著人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，創(chuàng) 建資源節(jié)約型、環(huán)境友好型社會(huì)的觀念日益深入人心，為進(jìn)一步推廣蛋白酶的生產(chǎn)與應(yīng)用 創(chuàng)造了有利條件。
[0003]目前市場上蛋白酶品種雖然多，但是所用生產(chǎn)菌株的種類較少，僅限于傳統(tǒng)上食 品加工用的微生物和確認(rèn)無害的菌株；另外，采用現(xiàn)有的生產(chǎn)蛋白酶的菌株的蛋白酶的產(chǎn) 量不大，且生產(chǎn)的蛋白酶的酶活不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明實(shí)施例提供一種假絲酵母蛋白酶制劑及其制備方法，主要目的 是開發(fā)新的制備蛋白酶制劑的菌種，制備出酶活較高的假絲酵母蛋白酶制劑，同時(shí)提高蛋 白酶制劑的產(chǎn)量。
[0005] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明主要提供如下技術(shù)方案：
[0006] 一方面，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，該方法包括 如下步驟：
[0007] 將星形假絲酵母菌制成星形假絲酵母菌發(fā)酵液；
[0008] 對所述星形假絲酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行鹽析處理，得到假絲酵母蛋白酶；
[0009] 將所述假絲酵母蛋白酶溶解于緩沖溶液后，進(jìn)行透析、提純處理，得到假絲酵母蛋 白酶液；
[0010] 將所述假絲酵母蛋白酶液超濾濃縮后，得到濃縮蛋白酶液；
[0011] 向所述濃縮蛋白酶液加入無機(jī)鹽、載體輔料，充分混合后得到混合物；
[0012] 對所述混合物進(jìn)行冷凍、干燥處理，得到假絲酵母蛋白酶制劑。
[0013] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，將星形假絲酵母菌制成星形假絲酵母菌 發(fā)酵液的步驟，包括：
[0014] 對星形假絲酵母菌進(jìn)行菌株誘變處理，得到誘變菌株；
[0015] 從所述誘變菌株中篩選出產(chǎn)酶菌株；其中，所述產(chǎn)酶菌株為能夠產(chǎn)生蛋白酶的星 形假絲酵母菌菌株；
[0016] 將所述產(chǎn)酶菌株活化后，接種于種子培養(yǎng)基，在28-37°C下培養(yǎng)18-24小時(shí)后，得 到種子液；
[0017] 將所述種子液以3-5%的接種量接種于第一發(fā)酵容器中，在28-37°C的溫度及 150-200轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度下，使所述第一發(fā)酵容器中的種子液發(fā)酵18-24小時(shí)，得到第 一發(fā)酵液；
[0018] 將所述第一發(fā)酵液以3-5%的接種量接種于第二發(fā)酵容器中，在35-42°C的溫度、 150-200轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度及0. 1-0. 3m3/h的通風(fēng)量的條件下，使所述第二發(fā)酵容器中的 第一發(fā)酵液發(fā)酵48-72小時(shí)，得到星形假絲酵母菌發(fā)酵液。
[0019] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，采用硫酸銨對所述星形假絲酵母菌發(fā)酵 液進(jìn)行鹽析處理。
[0020] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，所述緩沖溶液為pH值為5-7的乙酸-乙 酸鈉溶液。
[0021] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，對所述假絲酵母蛋白酶液進(jìn)行超濾濃 縮，得到濃縮蛋白酶液的步驟，具體為：
[0022] 用截留分子量為8000_15000Da的超濾膜對所述假絲酵母蛋白酶液進(jìn)行超濾、濃 縮，得到濃縮蛋白酶液；
[0023] 其中，所述假絲酵母蛋白酶液與所述濃縮蛋白酶液的體積比為6-10:1。
[0024] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，向所述濃縮蛋白酶液加入無機(jī)鹽、載體 輔料，充分混合后得到混合物的步驟具體為：
[0025] 向所述濃縮蛋白酶液加入無機(jī)鹽，攪拌均勻使無機(jī)鹽充分溶解，得到第一混合 物；
[0026] 向所述第一混合物中加入載體輔料，充分揉和，得到混合物。
[0027] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，所述第一混合物中所述無機(jī)鹽的濃度為 0. 5-1% ；
[0028] 所述載體輔料的添加量與第一混合物的重量比為0.8-1. 2:1。
[0029] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，所述載體輔料為玉米粉、米淀粉和豆餅 粉中的任一種或幾種的混合物。
[0030] 前述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，對所述混合物進(jìn)行冷凍、干燥處理，得到 假絲酵母蛋白酶制劑的步驟，包括：
[0031] 將所述混合物在真空度為30-50Pa、溫度為-18 --22°C的條件下冷凍8_10小時(shí)， 再將所述混合物在真空度為30-50Pa、溫度為-30--36°C的條件下冷凍15-18小時(shí)后，將冷 凍后的混合物粉碎、擠壓、切割，得到假絲酵母蛋白酶顆粒；
[0032] 將所述假絲酵母蛋白酶顆粒置于40-60°C下進(jìn)行干燥處理后，在其表面涂覆氫化 牛油后繼續(xù)干燥處理，得到假絲酵母蛋白酶制劑。
[0033] 另一方面，本發(fā)明實(shí)施例還提供一種假絲酵母蛋白酶制劑，所述假絲酵母蛋白酶 制劑由上述任一項(xiàng)所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法制備而成。
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例提出的一種假絲酵母蛋白酶制劑及其制備方法，至少具有如下優(yōu) 占.
[0035] 本發(fā)明實(shí)施例采用新的菌種假絲酵母制備出酶制劑，即假絲酵母蛋白酶制劑，所 用的假絲酵母菌種為新開發(fā)菌種，符合FAO/WHO食品添加劑專家委員會(huì)JECFA的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。 所用的假絲酵母菌種經(jīng)誘變選育產(chǎn)酶能力較高，制得假絲酵母蛋白酶制劑具有較高的酶活 力，酸性蛋白酶活力彡2125U/g干基，活力回收率到達(dá)51. 6%。
[0036] 進(jìn)一步地，本發(fā)明實(shí)施例制備的假絲酵母蛋白酶制劑以玉米粉、米淀粉和豆餅粉 中的一種或幾種為主要輔料，生產(chǎn)成本低；假絲酵母蛋白酶制劑在制備過程采用離心、超 濾、鹽析、透析、冷凍干燥等步驟，產(chǎn)品雜質(zhì)含量低，符合食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)的要求。
[0037] 進(jìn)一步地，本發(fā)明實(shí)施例在制備假絲酵母蛋白酶制劑的過程中無三廢（廢水、廢 渣、廢氣）排出，減少了能耗、運(yùn)行成本較低，清潔生產(chǎn)，具有較大的環(huán)境優(yōu)勢。且本發(fā)明提 供的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)酸性蛋白酶制劑。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 為更進(jìn)一步闡述本發(fā)明為達(dá)成預(yù)定發(fā)明目的所采取的技術(shù)手段及功效，以下結(jié)合 較佳實(shí)施例，對依據(jù)本發(fā)明提出的一種假絲酵母蛋白酶制劑及其制備方法其具體實(shí)施方 式、特征及其功效，詳細(xì)說明如下。
[0039] 在葡萄酒釀造初期，若添加星形假絲酵母菌，不僅利于葡萄酒的澄清，還能增加酒 體的穩(wěn)定性；本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)這是因?yàn)樾切渭俳z酵母菌能產(chǎn)生蛋白酶，蛋白酶葡萄酒 釀造初期的蛋白質(zhì)及含氮化合物水解掉，使其生成可溶性肽及氨基酸?；诖?，本發(fā)明的發(fā) 明人提出一種假絲酵母蛋白酶制劑及利用微生物液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)假絲酵母蛋白酶制劑的 方法，從而開發(fā)了新產(chǎn)酶菌株，且所制備的酶制劑具有較高且穩(wěn)定的酸性酶活力，適用于食 品工業(yè)。
[0040] 具體地，本發(fā)明實(shí)施例提出的一種假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，包括如下步 驟：
[0041] 1)將星形假絲酵母菌制成星形假絲酵母菌發(fā)酵液。該步驟具體包括：
[0042] 11)對星形假絲酵母進(jìn)行菌株誘變處理，得到誘變菌株。
[0043] 具體地，從培養(yǎng)假絲酵母菌體的固體平板上挑取星形假絲酵母（Candida stellata)的單菌落，將挑選出的星形假絲酵母的單菌落接種于酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng) 基上（具體地，將星形假絲酵母的單菌落接種于裝有20-30毫升酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng) 基的250毫升的三角瓶中），在25-37°C的溫度下于100-300轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)24-48 小時(shí)，得到發(fā)酵液。將發(fā)酵液放置在離心機(jī)中，在2000-8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下，離心3-10 分鐘，棄去上清液，用無菌水懸浮下層菌落（細(xì)胞），得到菌液，且菌液中的細(xì)胞濃度為 1X108-8X108個(gè)/毫升。吸取1-3毫升菌液放置于4°C冰箱中作為對照；從剩余的菌液中 吸取4-6毫升（優(yōu)選5毫升）加入無菌平板中，lX105-5X105J/mm2的計(jì)量處理無菌平板 (在此，J/mm2是能量密度單位，表示單位面積吸收的能量；表示無菌平板中的菌液，每1mm2 吸收紫外線能量為1X105-5X105J)。將磁力攪拌器置于紫外燈下照射30分鐘后，再將無 菌平板置于磁力攪拌器上，無菌平板等距放置，且距紫外燈30-40厘米處，照射10-30分鐘 后，得到第一誘變菌株。
[0044] 將第一誘變菌株放入微波源為2450MHz、850W的微波爐中，每照射10秒，冷卻10 秒后再照射10秒，重復(fù)多次，冷卻后，在28-37°C下培養(yǎng)24-72小時(shí)，得到誘變菌株。
[0045] 該步驟中，酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基的配方為（g/L):蛋白