] 2)產(chǎn)酶菌株篩選
[0119] 21)產(chǎn)酶菌株初篩：取誘變菌株的菌懸液0. 1毫升進(jìn)行10倍系列稀釋至KT-KT6， 分別取各個稀釋梯度1毫升涂布于酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基上，培養(yǎng)60小時后，取用檸檬酸 調(diào)pH值至6. 0的NaOH溶液，噴于平板上，選擇其中顯示透明圈直徑較大的菌株，作為初篩 菌株。
[0120] 酪蛋白分離篩選培養(yǎng)基的配方為（g/L):干酪素0.5、牛肉膏0.3、蛋白胨1.0、瓊脂 粉 1. 5、NaCl1. 0、蒸餾水 100mL;
[0121] 22)產(chǎn)酶菌株復(fù)篩：將初篩菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28°C的溫度下于300轉(zhuǎn)/ 分鐘的搖床上培養(yǎng)24小時。
[0122] 發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為（g/L):干酪素0.5、蛋白胨1.0、NaCl 1.0、牛肉膏0.3、蒸餾 水100mL。
[0123] 23)產(chǎn)酶菌株的獲得：將產(chǎn)酶菌株復(fù)篩處理后的菌液分別取1毫升于離心管中，在 離心機(jī)中以6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心8分鐘后，取上清液，并使上清液與酪蛋白溶液按照 體積比為1:1的比例混合，將上清液與酪蛋白的混合物在40°C水浴鍋中反應(yīng)10分鐘，加入 適量三氯乙酸終止反應(yīng)，得到反應(yīng)產(chǎn)物；取1毫升反應(yīng)產(chǎn)物，向反應(yīng)產(chǎn)物中加入福林酚試劑 1毫升，再加入Na2C03試劑5毫升后，搖勻，在紫外分光光度計(jì)680nm下測定吸光值；將吸光 值大的菌株篩選出來，即為本實(shí)施例所用的高產(chǎn)蛋白酶的星形假絲酵母菌株。
[0124] 3)種子液的制備：將星形假絲酵母菌株經(jīng)活化后，接種于種子培養(yǎng)基，在28°C的 溫度下于200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上培養(yǎng)18小時，得到為種子液。
[0125] 種子培養(yǎng)基的配方為（g/L):蛋白胨5. 0、酵母膏15. 0、氯化鈉4. 0、葡萄糖10. 0、 瓊脂 20. 0、蒸餾水 1000mL、pH7. 0 ;
[0126] 4)星形假絲酵母菌發(fā)酵液的培養(yǎng)：將步驟3)得到的種子液以5%的接種量接種 于發(fā)酵三角瓶中，在30°C的溫度下于200轉(zhuǎn)/分鐘的搖床上發(fā)酵18小時；然后以5%的接 種量接種于發(fā)酵罐中，在37°C的溫度下、200轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度、0.2m3/h的通風(fēng)量的條件 下，好氧發(fā)酵60小時，即得到星形假絲酵母菌菌液，備用；
[0127] 5)假絲酵母蛋白酶制劑的制備：
[0128] 51)發(fā)酵液的后處理：用截留分子量為10000的超濾膜對步驟4)制得的星形假絲 酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行超濾濃縮5倍，得到濃縮發(fā)酵液；將濃縮發(fā)酵液進(jìn)行硫酸銨鹽析分級沉 淀實(shí)驗(yàn)，確定硫酸銨分級沉淀的濃度為25% -70% ;將將濃縮發(fā)酵液在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘 的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘后得到第一上清液，向第一上清液中加入硫酸銨至25%的飽和度后， 將第一上清液與硫酸銨的混合物在4°C放置24小時后，再將第一上清液與硫酸銨的混合物 在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘后取上清液得到第二上清液，并向第二上清液 中繼續(xù)加入硫酸銨至70%飽和度，將第二上清液與硫酸銨的混合物在4°C放置24小時后， 在4°C、8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速下離心30分鐘后得到沉淀，收集沉淀，使其混合，將沉淀溶于 pH值為6. 0的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，充分透析，即得到提純后的假絲酵母蛋白酶液。
[0129] 52)真空冷凍干燥：用截留分子量為10000的超濾膜對假絲酵母蛋白酶液進(jìn)行超 濾濃縮10倍，得到濃縮蛋白酶液；向濃縮蛋白酶液中加入硫酸鎂（其中，硫酸鎂的加入量保 證第一混合物中硫酸鎂的濃度為0. 5% );充分?jǐn)嚢?、溶解后得到第一混合物；向第一混?物中加入等量米淀粉載體輔料（米淀粉的量與第一混合物的量一致），充分揉和得到第二 混合物。將第二混合物置于真空度40Pa、-20°C冷凍9小時后，再將其在-35°C冷凍15小 時，經(jīng)粉碎、擠壓、切割后即得假絲酵母蛋白酶濕顆粒；將假絲酵母蛋白酶濕顆粒在40°C干 燥后，在其表面涂氫化牛油后繼續(xù)干燥，即得包被型假絲酵母蛋白酶制劑。
[0130] 6)保存：常溫下避光、干燥保存。
[0131] 實(shí)施例4
[0132] 測定實(shí)施例1-實(shí)施例3制備的假絲酵母蛋白酶制劑的酶活力、酶活力回收率以及 10個月、12個月內(nèi)的酶活保存率，測定結(jié)果如表1所示。
[0133]表1
[0134]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： 將星形假絲酵母菌制成星形假絲酵母菌發(fā)酵液； 對所述星形假絲酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行鹽析處理，得到假絲酵母蛋白酶； 將所述假絲酵母蛋白酶溶解于緩沖溶液后，進(jìn)行透析、提純處理，得到假絲酵母蛋白酶 液； 將所述假絲酵母蛋白酶液超濾濃縮后，得到濃縮蛋白酶液； 向所述濃縮蛋白酶液加入無機(jī)鹽、載體輔料，充分混合后得到混合物； 對所述混合物進(jìn)行冷凍、干燥處理，得到假絲酵母蛋白酶制劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，將星形假絲 酵母菌制成星形假絲酵母菌發(fā)酵液的步驟，包括： 對星形假絲酵母菌進(jìn)行菌株誘變處理，得到誘變菌株； 從所述誘變菌株中篩選出產(chǎn)酶菌株；其中，所述產(chǎn)酶菌株為能夠產(chǎn)生蛋白酶的星形假 絲酵母菌菌株； 將所述產(chǎn)酶菌株活化后，接種于種子培養(yǎng)基，在28-37°C下培養(yǎng)18-24小時后，得到種 子液； 將所述種子液以3-5%的接種量接種于第一發(fā)酵容器中，在28-37°C的溫度及150-200 轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度下，使所述第一發(fā)酵容器中的種子液發(fā)酵18-24小時，得到第一發(fā)酵 液； 將所述第一發(fā)酵液以3-5 %的接種量接種于第二發(fā)酵容器中，在35-42°C的溫度、 150-200轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度及0. 1-0. 3m3/h的通風(fēng)量的條件下，使所述第二發(fā)酵容器中的 第一發(fā)酵液發(fā)酵48-72小時，得到星形假絲酵母菌發(fā)酵液。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，采用硫酸銨 對所述星形假絲酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行鹽析處理。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，所述緩沖溶 液為pH值為5-7的乙酸-乙酸鈉溶液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，對所述假絲 酵母蛋白酶液進(jìn)行超濾濃縮，得到濃縮蛋白酶液的步驟，具體為： 用截留分子量為8000-15000Da的超濾膜對所述假絲酵母蛋白酶液進(jìn)行超濾、濃縮，得 到濃縮蛋白酶液； 其中，所述假絲酵母蛋白酶液與所述濃縮蛋白酶液的體積比為6-10:1。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，向所述濃縮 蛋白酶液加入無機(jī)鹽、載體輔料，充分混合后得到混合物的步驟，具體為： 向所述濃縮蛋白酶液加入無機(jī)鹽，攪拌均勻使無機(jī)鹽充分溶解，得到第一混合物； 向所述第一混合物中加入載體輔料，充分揉和，得到混合物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，所述第一混 合物中所述無機(jī)鹽的濃度為〇. 5-1% ; 所述載體輔料的添加量與第一混合物的重量比為〇. 8-1. 2:1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，所述載體輔 料為玉米粉、米淀粉和豆餅粉中的任一種或幾種的混合物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，其特征在于，對所述混合 物進(jìn)行冷凍、干燥處理，得到假絲酵母蛋白酶制劑的步驟，包括： 將所述混合物在真空度為30-50Pa、溫度為-18 --22°C的條件下冷凍8-10小時，再將 所述混合物在真空度為30-50Pa、溫度為-30--36°C的條件下冷凍15-18小時后，將冷凍后 的混合物粉碎、擠壓、切割，得到假絲酵母蛋白酶顆粒； 將所述假絲酵母蛋白酶顆粒置于40-60°C下進(jìn)行干燥處理后，在其表面涂覆氫化牛油 后繼續(xù)干燥處理，得到假絲酵母蛋白酶制劑。
10. -種假絲酵母蛋白酶制劑，其特征在于，所述假絲酵母蛋白酶制劑由權(quán)利要求1-9 任一項(xiàng)所述的假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法制備而成。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種假絲酵母蛋白酶制劑及其制備方法，涉及生物工程領(lǐng)域，開發(fā)一種新的制備蛋白酶制劑的菌種。本發(fā)明主要技術(shù)方案為：假絲酵母蛋白酶制劑的制備方法，包括如下步驟：將星形假絲酵母菌制成星形假絲酵母菌發(fā)酵液；對星形假絲酵母菌發(fā)酵液進(jìn)行鹽析處理，得到假絲酵母蛋白酶；將假絲酵母蛋白酶溶解于緩沖溶液后，進(jìn)行透析、提純，得到假絲酵母蛋白酶液；將假絲酵母蛋白酶液超濾濃縮后，得到濃縮蛋白酶液；向濃縮蛋白酶液加入無機(jī)鹽、載體輔料，充分混合后得到混合物；對混合物進(jìn)行冷凍、干燥處理，得到假絲酵母蛋白酶制劑。本發(fā)明的制備方法成本低、環(huán)保、適用于工業(yè)化大批量生產(chǎn)酸性蛋白酶制劑；制備的蛋白酶制劑酶活力較高、穩(wěn)定性好。
【IPC分類】C12R1-72, C12N9-60
【公開號】CN104531645
【申請?zhí)枴緾N201410825894
【發(fā)明人】史學(xué)偉, 徐亞男, 王軍, 程衛(wèi)東
【申請人】石河子開發(fā)區(qū)石大合旭科技開發(fā)有限公司
【公開日】2015年4月22日
【申請日】2014年12月25日