檢測(cè)水稻高粒重等位基因的特異性pcr分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及水稻育種中的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測(cè)水稻粒重QTL qTGWl.2a^WqTGWl.上密陽(yáng)46高千粒重等位基因的8個(gè)特異性PCR標(biāo)記。
【背景技術(shù)】
[0002]目前，世界人口的增長(zhǎng)速率高于糧食增產(chǎn)速率，食物短缺已成為全球性安全問(wèn)題。水稻作為世界上一半人口的主食，提高其產(chǎn)量對(duì)解決糧食安全問(wèn)題具有重大意義。水稻的增產(chǎn)在經(jīng)歷了矮桿化和雜種優(yōu)勢(shì)利用之后，一直處于緩慢增長(zhǎng)狀態(tài)，近30年我國(guó)水稻新品種產(chǎn)量年提高幅度僅為1_2%，其中部分類(lèi)型甚至低于1%。在該緩慢增產(chǎn)階段，千粒重對(duì)產(chǎn)量提高發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。因此，在水稻新品種的選育過(guò)程中，千粒重的高低是育種家們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。高千粒重品種的培育常將需改良的品種和高千粒重的材料進(jìn)行雜交而獲得，千粒重的測(cè)定需等種子完全成熟后測(cè)量較為精確，且選育過(guò)程中待測(cè)樣本數(shù)量龐大，阻礙了育種進(jìn)程以及加大育種成本。隨著分子標(biāo)記的快速發(fā)展，借助分子標(biāo)記輔助選擇，利用合適的分子標(biāo)記能在水稻全生育期鑒定對(duì)千粒重起增效作用的等位基因在受體品種中的導(dǎo)入，從而從后代中選育出高千粒重的水稻品種。目前，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已經(jīng)在水稻抗病性，抗蟲(chóng)性以及耐鹽等性狀廣泛應(yīng)用。
[0003]申請(qǐng)人前期在水稻第I染色體上定位到3個(gè)控制水稻千粒重的QTUWang L-L, etal.Dissect1n of qTGWl.2 to three QTLs for grain weight and grain size in rice(Oryza sativa L.).Euphytica, DOI 10.1007/sl0681-014-1237_7)。在這 3 個(gè)QTL 區(qū)間，來(lái)源于水稻品種密陽(yáng)46的等位基因均具有提高千粒重的作用，而定位精度則以qTGWl.2a和qTGWl.2b為高。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，根據(jù)水稻品種密陽(yáng)46和珍汕97的重測(cè)序結(jié)果，針對(duì)qTGWl.2am qTGWl.所在區(qū)間進(jìn)行序列比對(duì)，設(shè)計(jì)序標(biāo)位(STS)標(biāo)記，并從中挑選出可特異性鑒定密陽(yáng)46等位基因的標(biāo)記。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記對(duì)水稻粒重QTL qTGWl.2a^qTGWl.上密陽(yáng)46增效等位基因的檢測(cè)具有普遍應(yīng)用價(jià)值，可以廣泛地應(yīng)用于qTGWl.2a和qTGWl.上密陽(yáng)46增效等位基因的轉(zhuǎn)育研究中。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了檢測(cè)qTGWl.為和qTGWl.上密陽(yáng)46高千粒重等位基因的特異性分子標(biāo)記8個(gè)，其中，檢測(cè)qTGWl.為的7個(gè)，檢測(cè)qTGWl.%的I個(gè)。
[0005]本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:根據(jù)密陽(yáng)46和珍汕97的重測(cè)序結(jié)果，對(duì)qTGWl.2a$\
在區(qū)間及其緊密連鎖區(qū)間的序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)插入和缺失情況，在該區(qū)段設(shè)計(jì)了 12個(gè)STS標(biāo)記，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室鑒定驗(yàn)證，篩選出8個(gè)在兩個(gè)品種中具有多態(tài)性的標(biāo)記。
[0006]用于檢測(cè)qTGWl.為上密陽(yáng)46高千粒重等位基因的標(biāo)記有7個(gè)，分別命名為Wn32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b 和 Wn33252，具體序列如下:
Wn32837的上游引物序列為5’ - CGTCCTGCGTTTCGACATGACT-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO:1所示的核苷酸序列； Wn32837的下游引物序列為5’ - TATTTCTACCACTCCAAGCACCA-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO:2所示的核苷酸序列；
Wn32886的上游引物序列為5’ - CGTGTTACTAACCCAGTCAACTCAGG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
Wn32886的下游引物序列為5’ - CAATAGTAGCAGCTAAATTGGCGTTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；
Wn32893的上游引物序列為5’ - TTCCGATTTTGTTTTCTTGGTCCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；
Wn32893的下游引物序列為5’ - GCCGCACATTTATTACCTTAATCCTG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；
Wn33185的上游引物序列為5’- GGAGGATAACGCAAGCAAACTTGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:7的所示核苷酸序列；
Wn33185的下游引物序列為5’ - CCATAGCTTGTAAAAGACAGTGCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDN0:8所示的核苷酸序列；
Wn33186的上游引物序列為5’- AGTTAGTGCAGCAATCTACGTCCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列；
Wn33186的下游引物序列為5’ - AGCTCCTCCAGTGACGATACGG-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 10所示的核苷酸序列；
Wn33304b的上游引物序列為5’- AAGCAACATAACTTATTCTACTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 11的所示核苷酸序列；
Wn33304b的下游引物序列為5’ - ACGACATCCACTTCGCACC-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 12所示的核苷酸序列；
Wn33252的上游引物序列為5’- GCATGTATCAAAGATTCGATGAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列；
Wn33252的下游引物序列為5’ - TGAAAACTCATGGCTACGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 14所示的核苷酸序列。
[0007]用于檢測(cè)qTGWl.上密陽(yáng)46高千粒重等位基因的標(biāo)記有I個(gè)，命名為Wn34526，具體序列如下:
Wn34526的上游引物序列為5’- TCATCATCTGTTCGTGGGTT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 15的所示核苷酸序列；
Wn34526的下游引物序列為5’ - TTGAAATATAAACTCTATACAATCTGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 16所示的核苷酸序列。
[0008]8個(gè)STS標(biāo)記的PCR擴(kuò)增體系一致。擴(kuò)增體系為，Tris-HCL (pH 8.8)33.5 mM,(NH4)2SO4 8.0 mM,MgCl2 1.5 mM, TWEEN-20 0.05%, dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各3.3 ng/μ?，Ti^DNA聚合酶2.0單位，模版DNA 50 ng ;PCR反應(yīng)條件除退火溫度外其它一致，預(yù)變性溫度94°C 2分鐘；變性溫度94°C 45秒、退火溫度50-55°C (Wn33815、Wn33252和Wn34526為50°C，其余5個(gè)標(biāo)記皆為55°C ) 45秒、72°C I分鐘，30個(gè)循環(huán)；72°C 8分鐘。
【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1 STS標(biāo)記Wn32886的檢測(cè)結(jié)果。
[0010]M:分子量對(duì)照；P1:珍汕97 ；P2:密陽(yáng)46 ；1~16:待測(cè)樣品圖2兩套近等基因系兩地種植的千粒重分布。
[0011]A.2014年春海南陵水為
B.2014年春海南陵水qTGWl.2b
C.2014年夏浙江富陽(yáng)776￥7.為
D.2014年夏浙江富陽(yáng)光。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0013]實(shí)施例1水稻千粒重QTL qTGWl.2a熱上密陽(yáng)46特異性分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)
利用序列比對(duì)軟件DNASTAR MegAlign模塊(Lasergene)對(duì)QTL定位群體的親本珍汕97和密陽(yáng)46在千粒重QTL qTGWl.為和qTGWl.%所在區(qū)間的堿基序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)2個(gè)品種在比對(duì)中表現(xiàn)出的插入或缺失位點(diǎn)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7.0開(kāi)發(fā)了 12個(gè)分別用于檢測(cè)qTGWl.2am qTGWl.增效等位基因密陽(yáng)46特異片段的STS標(biāo)記。通過(guò)下述步驟鑒定這些開(kāi)發(fā)的標(biāo)記是否在珍汕97和密陽(yáng)46之間存在特異性，且在分離群體中是否能準(zhǔn)確的鑒定出攜帶密陽(yáng)46等位基因。本發(fā)明以STS標(biāo)記Wn32886為例詳細(xì)介紹檢測(cè)方法:
1.DNA微量提取