> (I)將珍汕97、密陽46以及16個在分離群體中隨機挑選的單株種子分別置于預(yù)先標(biāo)號的培養(yǎng)皿，30°C發(fā)芽7天。
[0014](2)剪取各培養(yǎng)皿幼苗葉片2?3 cm，剪成0.5 cm長的碎片，放入2.0 mL離心管中。
[0015](3)加入450 μ I DNA提取液和一顆鋼珠，應(yīng)用組織研磨儀進行研磨。
[0016](4)加入450 μ I氯仿萃取液，蓋緊蓋子，上下顛倒混勻。
[0017](5)11,000 rpm離心2分鐘至清晰分相。吸取上清液400 μ 1，轉(zhuǎn)入新的1.5 ml離心管中，棄槍頭
(6)加入800 μ I預(yù)冷的無水乙醇,蓋緊蓋子,上下顛倒混勻。-20°C放置30分鐘。
[0018](7) 11，000 rpm離心3分鐘至沉淀附于離心管底部，棄上清液。
[0019](8)用70%乙醇洗滌沉淀2遍，將1.5 ml離心管倒置于紙上，自然干燥。
[0020](9)加入100 μ I的1/10XTE緩沖液溶解沉淀。
[0021 ] (10 )取 2 μ I 進行 PCR 擴增。
[0022]2.PCR擴增及檢測
擴增體系為，Tris-HCL (pH 8.8)33.5 mM, (NH4)2SO4 8.0 mM,MgCl2 1.5 mM, TWEEN-20
0.05%, dNTPs 0.2 mM，上、下游引物各 3.3 ng/μ?，7? DNA聚合酶 2.0 單位，模版DNA 50ng ；PCR反應(yīng)條件除退火溫度外其它一致，預(yù)變性溫度94°C 2分鐘；變性溫度94°C 45秒、退火溫度 50-55°C (Wn33815、Wn33252 和 Wn34526 為 50°C，其余 4 個標(biāo)記皆為 55°C ) 45 秒、72 °C I分鐘，30個循環(huán)；72 °C 8分鐘。
[0023]取2 μ I PCR產(chǎn)物上樣于6%非變性聚丙烯酰胺膠(PAGE);接通電極，在100V恒定電壓下電泳3小時，關(guān)閉電源；取下凝膠，銀染顯色。
[0024]如圖1所示，在Wn32886座位上，珍汕97和密陽46表現(xiàn)出多態(tài)性，在分離群體中，樣品3、4、7、8、10、11、12和14呈密陽46純合型，13和16呈雜合型，其余個體呈珍汕97純合型，說明該STS標(biāo)記能作為檢測密陽46控制水稻千粒重QTL qTGWl.為的特異標(biāo)記。通過該方法最終篩選出8個具有特異性的分子標(biāo)記，其中，7個用于檢測密陽46控制水稻千粒重QTL qTGWl.2a, I個檢測密陽46控制水稻千粒重QTL qTGWl.2b0
[0025]實施例2應(yīng)用特異性分子標(biāo)記鑒定密陽46高千粒重等位基因的驗證 I近等基因系構(gòu)建
采用實施例1建立的分子標(biāo)記，從水稻秈秈交組合珍汕97///珍汕97//珍汕97/密陽46的高代群體中篩選個體，建立了 2套近等基因系群體，分別在qTGWl.為和qTGWl.區(qū)間分離，其余背景區(qū)間一致。第I套在qTGWl.為分離，含珍汕97型和密陽46型近等基因系各39個；第2套在qTGWl.辦分離，含珍汕97型和密陽46型近等基因系各42個。
[0026]2表型鑒定
2013年冬一2014年春和2014年夏季分別在海南省陵水縣和浙江省富陽市中國水稻研究所試驗基地種植近等基因系，每個株系按隨機區(qū)組設(shè)計種植，設(shè)置2個重復(fù)，每個株系種8個單株，成熟后取中間5株測定千粒重。
[0027]3結(jié)果和分析
統(tǒng)計分析結(jié)果表明，在qTGWl.為區(qū)間，與珍汕97型株系相比，攜帶密陽46型等位基因的株系在陵水平均可提高千粒重0.52 g、在富陽平均可提高0.44 g ;在qTGWl.區(qū)間，與珍汕97型株系相比，攜帶密陽46型等位基因的株系在陵水平均可提高千粒重0.30 g、在富陽平均可提高0.31 g (圖2)。兩地試驗都證實了密陽46等位基因的導(dǎo)入可以提高千粒重，且效應(yīng)大小兩地高度一致。
[0028]實施例2證實了本發(fā)明提供的分子標(biāo)記對水稻粒重QTL qTGWl.2aM qTGWl.%中密陽46增效等位基因的檢測可靠性高，可以應(yīng)用于千粒重QTL qTGWl.2a^ qTGWUb中增效等位基因密陽46的轉(zhuǎn)育研究中。
【主權(quán)項】
1.檢測水稻粒重QTLqTGWl.為上密陽46高千粒重等位基因的7個特異性PCR標(biāo)記，分別命名為 fc32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b 和 Wn33252，具體序列如下: Wn32837的上游引物序列為5’ - CGTCCTGCGTTTCGACATGACT-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO:1所示的核苷酸序列； Wn32837的下游引物序列為5’ - TATTTCTACCACTCCAAGCACCA-3’，所述核苷酸序列為SEQID NO:2所示的核苷酸序列； Wn32886的上游引物序列為5’ - CGTGTTACTAACCCAGTCAACTCAGG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列； Wn32886的下游引物序列為5’ - CAATAGTAGCAGCTAAATTGGCGTTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列； Wn32893的上游引物序列為5’ - TTCCGATTTTGTTTTCTTGGTCCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列； Wn32893的下游引物序列為5’ - GCCGCACATTTATTACCTTAATCCTG-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列； Wn33185的上游引物序列為5’- GGAGGATAACGCAAGCAAACTTGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:7的所示核苷酸序列； Wn33185的下游引物序列為5’ - CCATAGCTTGTAAAAGACAGTGCC-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDN0:8所示的核苷酸序列； Wn33186的上游引物序列為5’- AGTTAGTGCAGCAATCTACGTCCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO:9的所示核苷酸序列； Wn33186的下游引物序列為5’ - AGCTCCTCCAGTGACGATACGG-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 10所示的核苷酸序列； Wn33304b的上游引物序列為5’- AAGCAACATAACTTATTCTACTC-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 11的所示核苷酸序列； Wn33304b的下游引物序列為5’ - ACGACATCCACTTCGCACC-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 12所示的核苷酸序列； Wn33252的上游引物序列為5’- GCATGTATCAAAGATTCGATGAGA-3’，所述核苷酸序列為SEQ ID NO: 13的所示核苷酸序列； Wn33252的下游引物序列為5’ - TGAAAACTCATGGCTACGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQIDNO: 14所示的核苷酸序列。
2.檢測水稻粒重QTLqTGWl.上密陽46高千粒重等位基因的I個特異性PCR標(biāo)記，命名為fc34526，具體序列如下: Wn34526的上游引物序列為5’- TCATCATCTGTTCGTGGGTT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 15的所示核苷酸序列； Wn34526的下游引物序列為5’ - TTGAAATATAAACTCTATACAATCTGCT-3’，所述核苷酸序列為SEQ IDNO: 16所示的核苷酸序列。
【專利摘要】本發(fā)明提供了檢測水稻粒重QTL（quantitative trait loci,數(shù)量性狀座位）qTGW1.2a和qTGW1.2b上密陽46高千粒重等位基因的8個特異性PCR標(biāo)記，其中，7個用于檢測qTGW1.2a，分別為Wn32837、Wn32886、Wn32893、Wn33185、Wn33186、Wn33304b和Wn33252，1個用于檢測qTGW1.2b，為Wn34526，特征在于其PCR引物。利用這8個標(biāo)記對水稻DNA進行鑒定，可以分別檢測待測材料是否在2個目標(biāo)座位上轉(zhuǎn)入水稻品種密陽46的高千粒重等位基因，即是否具有提高水稻粒重的能力，整個檢測過程操作簡單且準(zhǔn)確性高。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104561348
【申請?zhí)枴緾N201510037836
【發(fā)明人】朱玉君, 王琳琳, 莊杰云, 樊葉楊
【申請人】中國水稻研究所
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2015年1月26日