特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物及其應(yīng)用，通過光感基因調(diào)控技術(shù)特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性以影響焦慮行為。
【背景技術(shù)】
[0002]在我國一些大中城市，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，行業(yè)競爭越來越激烈，導(dǎo)致居民精神疾病總患病率升高，以深圳為例，居民精神疾病總患病率已達(dá)21.19%，高居全國首位，且在疾病總負(fù)擔(dān)中已高居首位，超過了惡性腫瘤、心腦血管等疾病。精神疾病中抑郁癥發(fā)病率逐漸上升，目前深圳市抑郁病患者不少于10萬人；同時(shí)精神分裂癥發(fā)病率居高不下，多發(fā)生于青壯年。焦慮癥是高速發(fā)展社會(huì)下人們常見的情感障礙，多在壓力下產(chǎn)生，如果焦慮處理不當(dāng)將會(huì)嚴(yán)重影響人們的工作學(xué)習(xí)，也給社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。焦慮樣情感的產(chǎn)生多和大腦異常的神經(jīng)活動(dòng)相關(guān)，目前已有研宄表明情感功能障礙在發(fā)病機(jī)制上多由相關(guān)腦區(qū)和神經(jīng)核團(tuán)中神經(jīng)元的異常放電和功能活動(dòng)改變導(dǎo)致，興奮性神經(jīng)元在執(zhí)行功能方面受到中間神經(jīng)元的調(diào)節(jié)。
[0003]中間神經(jīng)元(interneuron)是大腦中非常重要的一類神經(jīng)元，包括parvalbumin神經(jīng)元、somatostatin神經(jīng)元等若干亞類，對于調(diào)控興奮性神經(jīng)元活性和功能發(fā)揮重要作用，也在下丘腦的發(fā)育成熟和執(zhí)行功能過程中扮演重要角色。中間神經(jīng)元是近年來科學(xué)研宄的熱點(diǎn)，其功能異常已被發(fā)現(xiàn)與多種情感功能障礙相關(guān)，如抑郁、自閉癥和焦慮樣行為等。對中間神經(jīng)元進(jìn)行特異性調(diào)控，對于情感功能障礙發(fā)病機(jī)制的研宄、實(shí)現(xiàn)真正治療等具有重要意義。
[0004]目前對下丘腦中間神經(jīng)元進(jìn)行的調(diào)控的主要手段是通過基因操作或化學(xué)藥物的方法來實(shí)現(xiàn)?；瘜W(xué)藥物的方法缺乏空間和組織的特異性，在調(diào)控中間神經(jīng)元的同時(shí)也會(huì)刺激到其他正常細(xì)胞，如興奮性神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞等，這樣會(huì)導(dǎo)致一些對正常細(xì)胞不利的副作用或損傷作用；另外通過基因敲入或敲除后，對中間神經(jīng)元的調(diào)控在時(shí)間上不具有精確的可操控性。
[0005]光感基因調(diào)控技術(shù)是近幾年快速發(fā)展的一種新興技術(shù)，其原理是基于基因治療的方法給哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)入不同的對光敏感的基因，通過不同波長的光對特定細(xì)胞類型活性進(jìn)行調(diào)控。Channelrhodopsin-2 (ChR2)編碼陽離子通道蛋白，493nm波長的藍(lán)光光照后使陽離子進(jìn)入細(xì)胞，而興奮細(xì)胞活性。另外halorhodopsin (NpHR)編碼氯離子泵，592nm的黃光可以使帶有負(fù)電荷的氯離子進(jìn)入細(xì)胞而抑制細(xì)胞的活性；在Volvox carteri (團(tuán)藻)中分離的新光感蛋白VChRl的激發(fā)波長為589nm，使光調(diào)控的波長進(jìn)行紅移，可以方便結(jié)合鈣離子成像技術(shù)應(yīng)用；ChETA把ChR2的E123突變?yōu)樘K氨酸或丙氨酸，提高了對頻率較高的光照的敏感性和穩(wěn)定性；利用光感基因ChETA的電傳導(dǎo)性和快速動(dòng)力學(xué)特性，不僅可以實(shí)現(xiàn)通過光來誘導(dǎo)神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位；還可以調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性和突觸的傳遞性。
[0006]然而，目前并沒有利用光感基因調(diào)控技術(shù)對中間神經(jīng)元進(jìn)行特異性調(diào)控的研宄報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的主要目的在于提供一種能夠特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的技術(shù)。
[0008]為實(shí)現(xiàn)對下丘腦中間神經(jīng)元的特異性調(diào)節(jié)，本案發(fā)明人構(gòu)建了能特異性標(biāo)記下丘腦中間神經(jīng)元的攜帶光感基因的載體，并將攜帶光感基因的病毒載體轉(zhuǎn)染中間神經(jīng)元；利用可以發(fā)射特定波長藍(lán)光的發(fā)光裝置對中間神經(jīng)元進(jìn)行刺激，對下丘腦中間神經(jīng)元及其突觸進(jìn)行精確控制，促進(jìn)中間神經(jīng)元活性的改變，實(shí)現(xiàn)對焦慮樣行為的中樞調(diào)控。特別是通過對感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，增強(qiáng)中間神經(jīng)元的放電頻率和幅度，而導(dǎo)致焦慮樣行為增加。
[0009]具體而言，一方面，本發(fā)明提供了一種特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物，該組合物包括:
[0010]用于感染中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中包括啟動(dòng)子、光感基因、綠色熒光標(biāo)記基因，其中，所述啟動(dòng)子為VGAT啟動(dòng)子；
[0011]能產(chǎn)生藍(lán)光的光照裝置，用于對感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性。
[0012]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物也可以稱為一種“套組”，其中包括了本發(fā)明中特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性中所采用的各試劑、材料及儀器設(shè)備等組件，作為一種產(chǎn)品例如試劑盒的形式，各組件可按照預(yù)定的位置在大包裝中分別放置或是獨(dú)立包裝后成套銷售及使用。
[0013]在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，構(gòu)建了用于感染中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中的啟動(dòng)子為VGAT啟動(dòng)子；光感基因?yàn)镃hR2 ;綠色熒光標(biāo)記基因?yàn)镚FP ;所述病毒為腺相關(guān)病毒包裝載體(Invitrogen公司產(chǎn)品)；具體的構(gòu)建過程可以參照所屬領(lǐng)域中的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的能產(chǎn)生藍(lán)光的光照裝置主要是用于對離體的或在體的感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性，這樣的光照裝置可以商購獲得，當(dāng)用于對在體的感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控時(shí)，光照裝置通常還包括作為光傳導(dǎo)介質(zhì)的光纖。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物還可進(jìn)一步包括:使所述攜帶光感基因的病毒載體感染中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的試劑材料。具體地，這些材料可以是包括脂質(zhì)體(Invitrogen公司產(chǎn)品)等。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，本發(fā)明中所述的特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物中，所述藍(lán)光為波長460?480nm的藍(lán)光，優(yōu)選為波長473nm的藍(lán)光。
[0017]另一方面，本發(fā)明提供了所述的特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物在制備焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)中的應(yīng)用。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)是利用所述的組合物中的攜帶光感基因的病毒載體感染下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞，并通過光照裝置對感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，以調(diào)控焦慮樣行為。
[0019]具體實(shí)施時(shí)，所述焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)可以是用于對離體的感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，也可以是用于對在體的感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激。當(dāng)所述焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)用于對離體的感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激時(shí)，藍(lán)光光照條件優(yōu)選為:藍(lán)光波長473nm，光強(qiáng)I?2mff ;光刺激的相關(guān)參數(shù)為12.5?25ms每次，間隔12.5?25ms，占空比1: 1，光照頻率20?40Ηζο當(dāng)所述焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)是用于對在體的感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，該系統(tǒng)還包括用于將藍(lán)光傳導(dǎo)至感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞的光纖，所述光纖直徑200 μ m，藍(lán)光光照條件為:藍(lán)光波長473nm，光照的平均強(qiáng)度為10?20mW/mm2，光照頻率20?40Hz。
[0020]另一方面，本發(fā)明還提供了一種焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括本發(fā)明所述的特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的組合物。
[0021]另一方面，本發(fā)明還提供了所述的特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的組合物或所述的焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)在建立由下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞活性改變而導(dǎo)致焦慮樣行為增加的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械膽?yīng)用。具體地，所述組合物或焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)是通過對感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，增強(qiáng)中間神經(jīng)元的放電頻率和幅度，而建立焦慮樣行為增加的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。在本發(fā)明的一具體實(shí)施方案中，建立了小鼠的焦慮模型，從而可進(jìn)一步探討研宄調(diào)控中間神經(jīng)元對焦慮樣行為產(chǎn)生的影響。
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