22]本發(fā)明的有益技術(shù)效果:本發(fā)明的技術(shù)可以精確地特異性調(diào)控下丘腦的中間神經(jīng)元，可以有效的影響焦慮樣行為，從而可進(jìn)一步為情感功能障礙發(fā)病機制及治療的研宄提供實驗依據(jù)，具有重要意義。
【附圖說明】
[0023]圖1A:下丘腦區(qū)中的中間神經(jīng)元分布；
[0024]圖1B:VMH腦區(qū)中的中間神經(jīng)元分布。
[0025]圖2:攜帶光基因的病毒載體成功感染下丘腦的中間神經(jīng)元。
[0026]圖3:藍(lán)光刺激中間神經(jīng)元增強其放電頻率和幅度，導(dǎo)致焦慮行為增加。
[0027]圖4:通過光纖對VMH腦區(qū)進(jìn)行光照。
[0028]圖5:在體光調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活動后礦場行為明顯發(fā)生改變，導(dǎo)致焦慮行為增加。
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照所屬領(lǐng)域的常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0030]以下實施例中，所用原始試劑和材料均可商購獲得，或可按照現(xiàn)有技術(shù)的記載制備得到。
[0031]實施例1
[0032]本實施例的方案主要包含下述幾個方面:1)構(gòu)建攜帶光感基因的病毒載體并感染下丘腦的中間神經(jīng)元；2)利用473nm的藍(lán)光刺激下丘腦的中間神經(jīng)元或投射末梢并記錄光電流，從而驗證光基因?qū)χ虚g神經(jīng)元的興奮作用；3)通過在體光刺激的方法研宄調(diào)控中間神經(jīng)元的活性后對焦慮樣行為的調(diào)控作用，進(jìn)一步可利用焦慮的小鼠模型，通過在體特定頻率的影響神經(jīng)元的活性，來評估對焦慮行為嚴(yán)重程度的影響。具體實施操作如下:
[0033]I)構(gòu)建攜帶光基因的病毒載體并感染中間神經(jīng)元
[0034]將攜帶光感基因的載體(ChR2質(zhì)粒，invitrogen公司產(chǎn)品)、綠色焚光基因(GFP, invitrogen公司產(chǎn)品)和中間神經(jīng)元特異性的啟動子質(zhì)粒(VGAT啟動子，Invitrogen公司產(chǎn)品)，和慢病毒包裝的質(zhì)粒PCMV Δ R8.74、pMD2.G.(1.5 μ g) —起，利用脂質(zhì)體(Invitrogen公司產(chǎn)品)一起轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞(ATCC公司產(chǎn)品，該細(xì)胞傳代至25代后即需要更換新的一批細(xì)胞株)中(每200，000個細(xì)胞用6mg/L脂質(zhì)體)，24hr后用含有5mM丙酮酸鈉的DMEM替代原293FT細(xì)胞的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，16小時后，利用超速離心機在50，OOOg速度下破膜，將懸液通過20%的蔗糖濾柱，收集上清。該病毒滴度能達(dá)3 X 108TU/mL以上，產(chǎn)出的病毒顆粒以滅菌的磷酸鹽緩沖液以1:1000的體積比進(jìn)行重懸。將獲取的病毒按1:400的體積比混入無血清DMEM中，用于感染目標(biāo)細(xì)胞:下丘腦的中間神經(jīng)元。
[0035]圖1A為下丘腦區(qū)中的中間神經(jīng)元分布，圖1B為VMH腦區(qū)中的中間神經(jīng)元分布。
[0036]利用上述的攜帶光感基因的病毒載體感染下丘腦的中間神經(jīng)元(感染濃度為1:500)，感染241^后用含10%血清的培養(yǎng)基替代感染時的無血清培養(yǎng)基后繼續(xù)觀察，在48hr后可以觀察到神經(jīng)元有綠色熒光表達(dá)。參見圖2，可表明攜帶光基因的病毒載體成功感染下丘腦的中間神經(jīng)元。
[0037]2)以膜片鉗技術(shù)對中間神經(jīng)元表達(dá)的光敏通道蛋白的進(jìn)行功能驗證。
[0038]采用激光刺激系統(tǒng)(上海光源)對上述感染了攜帶光基因的病毒載體的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光刺激，藍(lán)光波長473nm，光強1.1mW左右；光刺激的相關(guān)參數(shù)為20ms每次，間隔20ms，占空比1:1，光照頻率30Hzο
[0039]以電壓鉗的形式記錄下游神經(jīng)元的IPSC，結(jié)果參見圖3，表明在特定的藍(lán)光照射條件下，可增強中間神經(jīng)元的放電頻率和幅度，中間神經(jīng)元的活性增強。
[0040]3)利用光基因載體對在體的中間神經(jīng)元進(jìn)行活性調(diào)節(jié)，在對應(yīng)位置植入直徑200 ym的光纖(參見圖4)，然后通過藍(lán)光刺激在體下丘腦中的中間神經(jīng)元，藍(lán)光波長473nm，光照的平均強度為10mW/mm2，光照頻率35Hz，在照射的同時對小鼠的焦慮樣行為通過曠場試驗進(jìn)行評估。
[0041]曠場試驗評估結(jié)果參見圖5，圖中左邊圖片為對照組，右邊圖片為本實施例中通過光調(diào)控影響中間神經(jīng)元活性的實驗組，從圖中顯示，小鼠調(diào)控中間神經(jīng)元活性后小鼠曠場行為發(fā)生明顯改變，導(dǎo)致焦慮行為增加，反映小鼠焦慮樣行為被調(diào)控。
【主權(quán)項】
1.一種特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物，該組合物包括: 用于感染中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中包括啟動子、光感基因、綠色熒光標(biāo)記基因，其中，所述啟動子為VGAT啟動子； 能產(chǎn)生藍(lán)光的光照裝置，用于對感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，該組合物還包括: 使所述攜帶光感基因的病毒載體感染中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的試劑材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述藍(lán)光為波長460?480nm的藍(lán)光，優(yōu)選為波長473nm的藍(lán)光。
4.權(quán)利要求1?3任一項所述的組合物在制備焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其中，所述焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)是利用所述的組合物中的攜帶光感基因的病毒載體感染下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞，并通過光照裝置對感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，以調(diào)控焦慮樣行為。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)是用于對離體的感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，藍(lán)光光照條件為:藍(lán)光波長473nm，光強I?2mW ;光刺激的相關(guān)參數(shù)為12.5?25ms每次，間隔12.5?25ms，占空比1:1，光照頻率20?40Hz。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其中，所述焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)是用于對在體的感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，該系統(tǒng)還包括用于將藍(lán)光傳導(dǎo)至感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞的光纖，所述光纖直徑200 μπι，藍(lán)光光照條件為:藍(lán)光波長473nm，光照的平均強度為10?20mW/mm2，光照頻率20?40Hz。
8.一種焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括權(quán)利要求1?3任一項所述的組合物。
9.權(quán)利要求1?3任一項所述的組合物或權(quán)利要求8所述的焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)在建立由下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞活性改變而導(dǎo)致焦慮樣行為增加的動物實驗?zāi)Ｐ椭械膽?yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述組合物或焦慮樣行為調(diào)控系統(tǒng)是通過對感染后的下丘腦中間神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)光光照刺激，增強中間神經(jīng)元的放電頻率和幅度，而建立焦慮樣行為增加的動物實驗?zāi)Ｐ汀?br>【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物及其應(yīng)用，通過光感基因調(diào)控技術(shù)特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性以影響焦慮行為。一種特異性調(diào)控下丘腦中間神經(jīng)元活性的光照調(diào)控組合物，該組合物包括：用于感染中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞的攜帶光感基因的病毒載體；該載體中包括啟動子、光感基因、綠色熒光標(biāo)記基因，其中，所述啟動子為VGAT啟動子；能產(chǎn)生藍(lán)光的光照裝置，用于對感染后的中間神經(jīng)元細(xì)胞或其前體細(xì)胞進(jìn)行光照調(diào)控以改變其活性。本發(fā)明的技術(shù)可以精確地特異性調(diào)控下丘腦的中間神經(jīng)元，可以有效的影響焦慮樣行為。
【IPC分類】C12N13-00, C12N5-10, A01K67-027, C12N15-86
【公開號】CN104593419
【申請?zhí)枴緾N201410855349
【發(fā)明人】楊帆, 劉運輝, 屠潔, 王立平
【申請人】深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月31日