一種全血樣本快速裂解試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于體外診斷試劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種全血樣本快速裂解試劑盒及其 檢測(cè)方法，可對(duì)全血樣本中白細(xì)胞及病原體的核酸進(jìn)行快速提取。
【背景技術(shù)】
[0002] 核酸檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展將分子診斷推向了前所未有的高水平。核酸檢測(cè)的第一 步就是對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取。從全血樣本中提取白細(xì)胞的核酸一直是比較復(fù)雜的過(guò)程，首 先涉及到對(duì)全血中的紅細(xì)胞進(jìn)行裂解，離心除去不含DNA的紅細(xì)胞，然后使用細(xì)胞裂解液 對(duì)白細(xì)胞進(jìn)行裂解，釋放出核酸。該樣本還需進(jìn)行多個(gè)抽提和純化步驟，才能得到直接用于 分子檢測(cè)的核酸。對(duì)全血樣本中的病原體進(jìn)行檢測(cè)也是臨床上常見(jiàn)的檢測(cè)項(xiàng)目，獲得全血 中病原體的核酸同樣要經(jīng)歷上述復(fù)雜的抽提過(guò)程。而且臨床樣本中的病原體含量往往較 低，因此病原體的核酸提取效率高低是至關(guān)重要的，直接影響到實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率。
[0003] 現(xiàn)在檢測(cè)機(jī)構(gòu)用得較多的對(duì)全血中白細(xì)胞和病原體的核酸進(jìn)行提取的方法包括 Trizol提取法（如Life Technology公司等)，柱提法（如Qiagen、Roche公司等）和磁珠法 (Chemagen、Thermo公司等)。Trizol提取法提取的核酸得率相對(duì)較低，且步驟較為繁雜，整 個(gè)提取過(guò)程耗時(shí)1-2小時(shí)，直接影響檢測(cè)效率。柱提法和磁珠法的試劑盒在一定程度上提 高了核酸提取效率，對(duì)部分核酸提取步驟進(jìn)行了簡(jiǎn)化，對(duì)提取速度進(jìn)行了一定的提升，但整 個(gè)提取過(guò)程仍需0. 5-1小時(shí)。除了提取時(shí)間長(zhǎng)，這些提取試劑盒的價(jià)格都極為昂貴，每一個(gè) 樣本的的提取約需人民幣30-50元不等。因此針對(duì)全血樣本的基因診斷急需操作簡(jiǎn)單、快 速、價(jià)格低廉的樣本前處理試劑，尤其當(dāng)臨床檢測(cè)樣本量較大時(shí)，簡(jiǎn)單快速的核酸提取顯得 尤為重要。
[0004] 由于目前使用的全血樣本核酸提取試劑盒及檢測(cè)方法存在操作時(shí)間長(zhǎng)、成本高、 檢測(cè)靈敏度低等問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種全血樣本快速裂解試劑盒及其檢測(cè)方法，僅需簡(jiǎn) 單的三步就可以完成核酸提取，整個(gè)提取過(guò)程不超過(guò)10分鐘，既簡(jiǎn)化核酸提取過(guò)程，同時(shí) 也大大節(jié)約成本，且無(wú)需進(jìn)行純化便可直接用于擴(kuò)增。由于本試劑盒具備核酸得率高、實(shí)驗(yàn) 操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)條件簡(jiǎn)易、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于對(duì)全血樣本中白細(xì)胞以及病原體的核 酸進(jìn)行快速提取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種全血樣本快速裂解試劑盒，提取的核酸可直接用 于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0006] 為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明的具體技術(shù)路線為： 1)從各種去污劑著手，篩選裂解細(xì)胞能力強(qiáng)的去污劑和最佳配比，以使整個(gè)裂解過(guò)程 只需2分鐘加熱便能最大程度地釋放病毒樣本核酸。
[0007] 2)在裂解細(xì)胞、釋放核酸的同時(shí)，由于核酸的質(zhì)量會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效果，需采用 防止核酸降解，尤其需要研究防止RNA降解的技術(shù)。
[0008] 通過(guò)反復(fù)的摸索，確定了全血樣本快速裂解試劑盒各組成成分及濃度，該試劑盒 核酸得率高、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)設(shè)備且成本低廉。
[0009] 本發(fā)明所提供的全血樣本快速裂解試劑盒包括：（1)裝有全血樣本裂解液的試劑 瓶或管，和（2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其特征在于全血樣本裂解液由月 桂?；“彼徕c、二硫蘇糖醇、TE (pH7. 4)組成。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是全血樣本裂解液中月桂?；“彼徕c的最佳濃 度為12g/L。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是全血樣本裂解液中二硫蘇糖醇的濃度為40mmol/ L ?200mmol/L。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案是全血樣本裂解液中TE (pH7.4)由20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA 組成，pH 為 7. 4。
[0013] 本發(fā)明提供的全血樣本快速裂解試劑盒可以提取全血樣本中白細(xì)胞和病原體的 核酸，其中病原體包括細(xì)菌、DNA病毒及RNA病毒，核酸包括DNA和RNA。
[0014] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種全血樣本快速裂解的檢測(cè)方法，包括如下步驟： (1) 取抗凝全血25 μ 1置于離心管中，加入25 μι全血樣本裂解液，用槍頭吹吸混勻； (2) 將混合物置于95 °C孵育2 min; (3) 將孵育后的混合物在12, 000 rpm條件下離心3 min，收集上清，即為全血樣本的核 酸提取物。
[0015] 該核酸提取物可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，也可置于-20 °C長(zhǎng)期保存。
[0016] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)：①全血樣本無(wú)需分離白細(xì)胞，可直接用于 核酸提取；②組分簡(jiǎn)單，且無(wú)昂貴的試劑，大大節(jié)約成本；③步驟簡(jiǎn)單，僅需三步；④提取速 度快，整個(gè)提取過(guò)程不超過(guò)10分鐘；⑤樣本中的核酸均保留在全血樣本裂解液中，核酸沒(méi) 有損失，且無(wú)需純化，即可用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測(cè)，靈敏度高于現(xiàn)有技術(shù)。⑥無(wú)需核 酸提取儀等復(fù)雜的設(shè)備，僅需水浴鍋和離心機(jī)即可完成操作。
[0017] 因此，本發(fā)明的試劑盒可廣泛用于對(duì)全血樣本中白細(xì)胞以及病原體的核酸進(jìn)行快 速提取，特別是待測(cè)全血樣本數(shù)量較多時(shí)尤為適用。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1顯示本試劑盒提取全血樣本的核酸進(jìn)行白細(xì)胞GAPDH基因 DNA、mRNA以及金 黃葡萄球菌熒光PCR檢測(cè)結(jié)果。白細(xì)胞GAPDH基因 DNA和mRNA以及金黃葡萄球菌擴(kuò)增曲 線均為S型曲線，Ct值分別為17. 58、16. 27和18. 41，均為陽(yáng)性。
[0019] 圖：2顯示本試劑盒對(duì)全血樣本中提取的金黃色葡萄球菌進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)的結(jié) 果。全血樣本中不同濃度梯度的金黃葡萄球菌除濃度I X IO3CFUAiI的樣本無(wú) Ct值判為陰 性外，其余濃度的樣本擴(kuò)增曲線均呈S型，Ct值分別為18. 41、21. 36、24. 29、26. 67,可明確 判為陽(yáng)性。
[0020] 圖3顯示本試劑盒提取的核酸與Qiagen柱提法提取的核酸進(jìn)行人似/??基因 熒光定量PCR的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Qiagen柱提法結(jié)果Ct值為23. 39,本試劑盒結(jié)果Ct值為 21. 98,比Qiagen柱提法的Ct值提前1. 41。兩條曲線均為S型曲線，且差異不大。
[0021] 圖4顯示本試劑盒提取的核酸與Qiagen柱提法提取的核酸進(jìn)行金黃葡萄球菌熒 光定量PCR的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果。Qiagen柱提法熒光PCR結(jié)果Ct值為25. 44,本試劑盒熒光 PCR結(jié)果Ct值為23. 94,比Qiagen柱提法的Ct值提前1. 5。兩條曲線均為S型曲線，且本 試劑盒熒光PCR的熒光值略高。
[0022] 圖5顯示本試劑盒對(duì)全血樣本中提取的沙門(mén)氏菌進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)結(jié)果。沙門(mén)氏 菌陽(yáng)性的全血樣本擴(kuò)增曲線為S型曲線，Ct值為23. 64,檢測(cè)為沙門(mén)氏菌陽(yáng)性。
[0023] 圖6顯示本試劑盒對(duì)全血樣本中提取的HCV進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)結(jié)果。兩份臨床 HCV陽(yáng)性的全血樣本擴(kuò)增曲線均為S型曲線，Ct值分別為29. 54和29. 77,檢測(cè)均為HCV陽(yáng) 性。
[0024] 圖7使用本試劑盒對(duì)全血樣本中提取的EBV進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)結(jié)果。三份臨床 EBV陽(yáng)性的全血樣本擴(kuò)增曲線均為S型曲線，Ct值分別為21. 19、21. 21和21. 03,檢測(cè)均為 EBV陽(yáng)性。
[0025] 圖8顯示本試劑盒對(duì)全血樣本中提取的白細(xì)胞核酸進(jìn)行PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。從圖 中可以看到從上到下三條帶，分別為基因組DNA、28S rRNA (約5kb)、18S rRNA (約1.9kb)。
[0026] 圖9顯示不同二硫蘇糖醇濃度的全血裂解液進(jìn)行PCR電泳檢測(cè)結(jié)果。泳道1-7分 別對(duì)應(yīng)二硫蘇糖醇濃度 0、20mM、40mM、80mM、120mM、160mM* 200mM。
[0027]
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明實(shí)施方式的描述，旨在通過(guò)舉例說(shuō)明更好地理解本發(fā)明的本質(zhì)，而不是限 制本發(fā)明。本發(fā)明實(shí)施方式所用的實(shí)驗(yàn)材料，如沒(méi)有特別說(shuō)明，均為市售產(chǎn)品。
[0029] 實(shí)施例1 :全血樣本快速裂解試劑盒制備及其使用方法 1、制備全血樣本快速裂解試劑盒（50測(cè)試/盒）：全血樣本裂解液（I. 25ml /管）1管。
[0030] 2、標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存 取受檢者靜脈血2 ml于含有EDTA或枸櫞酸鈉抗凝劑(禁止使用肝素抗凝)的無(wú)菌離心 管中備用。
[0031] 新鮮全血樣本在室溫條件下保存不超過(guò)6小時(shí)；后續(xù)全血樣本用于DNA檢測(cè)可 在-20±5 °C條件下長(zhǎng)