期保存，用于RNA檢測可在-80 °C ±5 °C條件下長期保存；樣本應(yīng) 避免反復(fù)凍融，凍融次數(shù)不得超過3次。
[0032] 凍存樣本解凍后應(yīng)充分混勻。
[0033] 3、檢測步驟 (1) 取抗凝全血25 μ 1置于離心管中，加入25 μι全血樣本裂解液，用槍頭吹吸混勻； (2) 將混合物置于95 °C孵育2 min; (3) 將孵育后的混合物在12, 000 rpm條件下離心3 min，收集上清，即為全血樣本的核 酸提取物。
[0034] 該核酸提取物可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測，也可置于-20 °C長期保存。
[0035] 實(shí)施例2 :使用本試劑盒提取全血樣本的核酸進(jìn)行白細(xì)胞GAPDH基因 DNA、mRNA以 及金黃葡萄球菌熒光PCR檢測。
[0036] 1、取EDTA抗凝全血25μ1置于PCR管中，加入少量金黃色葡萄球菌菌體，震蕩混 勻； 2、 取實(shí)施例1的全血樣本快速裂解試劑盒，上述樣本里加入25 μ?全血樣本裂解液，用 槍頭吹吸混勻； 3、 將混合物置于95 °C孵育2 min，孵育后的混合物在12, OOO rpm離心3分鐘，收集上 清，即得到樣本的核酸； 4、 取2μ1核酸樣本進(jìn)行熒光PCR或熒光RT-PCR擴(kuò)增。
[0037] 1)使用上游引物 GAPDHl F，序列為 5' -CCACTCCTCCACCTTTGAC-3'（SEQ ID NO : 1)，下游引物GAPDH1R，序列為5'-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3'（SEQIDN0:2)和熒光探針 GAPDHl probe，序列為 5'-TTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3' （SEQ ID NO :3)，探針的兩端分 別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex Taq? (Probe qPCR)(貨號RR390Q)，按照試劑盒說明配制反應(yīng)體系，對白細(xì)胞GAPDH基因 DNA進(jìn) 行熒光 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 95°C 30s (I cycle), 95°C 10s, 58°C 40s (40 cycles)。
[0038] 2)使用上游引物 Staph F，序列為 5' -CAGCAGCCGCGGTAATA-3'（SEQ ID NO :4)， 下游引物 Staph R，序列為 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCC-3'（SEQ ID N0:5)和熒光探針 Staph probe，序列為 5'-CTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3'（SEQ ID N0:6)，探針的兩 端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex Taq? (Probe qPCR)(貨號RR390Q)，按照試劑盒說明配制反應(yīng)體系，對金黃色葡萄球菌16S rDNA 進(jìn)行熒光 PCR 擴(kuò)增；擴(kuò)增條件為 95°C 30s (I cycle), 95°C 10s, 58°C 40s (40 cycles)。
[0039] 3)使用上游引物 GAPDH2 F，序列為 5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3' (SEQ ID NO ： 7)，下游引物GAPDH2R，序列為5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'（SEQIDN0:8)和熒光 探針 GAPDH2 probe ，序列為 5'-CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC-3'（SEQ ID NO :9)，探針的兩 端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，并使用Takara公司的One Step PrimeScript?RT-PCR Kit (Perfect Real Time)(貨號 RR064A)，按照試劑盒說明配制反應(yīng) 體系，對人GAPDHmRNA進(jìn)行熒光RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為42°C 20min (I cycle), 95°C 30s (I cycle), 95°C 10s，58°C 40s (40 cycles)。
[0040] 如附圖I所示：本試劑盒提取全血樣本的核酸進(jìn)行白細(xì)胞GAPDH基因 DNA、mRNA以 及金黃葡萄球菌進(jìn)行熒光PCR檢測結(jié)果均為陽性。
[0041] 實(shí)施例3 :使用本試劑盒對全血樣本中提取的金黃色葡萄球菌進(jìn)行靈敏度試驗(yàn)。
[0042] 1、取EDTA抗凝全血9〇μ1置于PCR管中，加入IX 109CFU/ml金黃色葡萄球菌1〇μ1， 震蕩混勻； 2、 取該樣本1〇μ1加入9〇μ1 EDTA抗凝全血中，震蕩混勻；依此進(jìn)行稀釋得到分別含 有金黃色葡萄球菌濃度為 I X l〇7CFU/ml, I X 106CFU/ml, I X 105CFU/ml, I X 104CFU/ml、 I X 103CFU/ml的全血樣本； 3、 取各稀釋度的全血樣本25μ1置于PCR管中； 4、 取實(shí)施例1的全血樣本快速裂解試劑盒，往上述樣本里加入25 μ?全血樣本裂解液， 用槍頭吹吸混勻； 5、 將混合物置于95 °C孵育2 min，孵育后的混合物在12, 000 rpm離心3分鐘，收集上 清，即得到樣本的核酸； 6、 取2μ1核酸樣本進(jìn)行進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增。使用上游引物Staph F， 序列為 5' -CAGCAGCCGCGGTAATA-3' （SEQ ID NO :4)，下游引物 Staph R 5'-GGACTACCAGGGTATCTAATCC_3'（SEQ ID NO:5)和熒光探針 Staph probe，序列為 5'-CT GTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGC-3'（SEQ ID N0:6)，探針的兩端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán) FAM和熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，并使用Takara公司的Premix Ex Taq? (Probe qPCR)(貨號 RR390Q)，按照試劑盒說明配制反應(yīng)體系，對金黃色葡萄球菌16S rDNA進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增； 擴(kuò)增條件為 95°C 30s (I cycle), 95°C 10s, 58°C 40s (40 cycles)。
[0043] 如附圖2所示檢測結(jié)果可知，本試劑盒對全血樣本中提取的金黃色葡萄球菌靈敏 度為 lX104CFU/ml。
[0044] 實(shí)施例4 :以添加金黃色葡萄球菌的全血為樣本，本試劑盒提取的核酸與Qiagen 柱提試劑（QIAamp DNA Mini Kit，貨號51304)提取的核酸用于熒光定量PCR的對比實(shí)驗(yàn)結(jié) 果。
[0045] 兩種核酸提取方法的操作步驟對比見下表：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種全血樣本快速裂解試劑盒，試劑盒包括：（1)裝有全血樣本裂解液的試劑瓶或 管，和（2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中全血樣本裂解液由月桂酰基肌氨 酸鈉、二硫蘇糖醇、PH7. 4的TE組成。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于全血樣本裂解液中月桂?；“彼徕c 的最佳濃度為12g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于全血樣本裂解液中二硫蘇糖醇的濃度 為 40mmol/L ?200mmol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征還在于全血樣本裂解液中pH7. 4的TE由 20mmol/L Tris-HCl、2mmol/L EDTA 組成，pH 為 7. 4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，用于提取全血樣本中白細(xì)胞和病原體的核酸，其中 病原體包括細(xì)菌、DNA病毒及RNA病毒，核酸包括DNA和RNA。
6. -種全血樣本快速裂解的檢測方法，包括如下步驟： 取抗凝全血25 ill置于離心管中，加入25耵全血樣本裂解液，用槍頭吹吸混勻； 將混合物置于95 °C孵育2 min ; 將孵育后的混合物在12, 000 rpm條件下離心3 min，收集上清，即為全血樣本的核酸提 取物。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其中全血樣本的核酸提取物可直接用于PCR擴(kuò)增 或熒光PCR檢測，也可置于-20 °C長期保存。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種全血樣本快速裂解試劑盒及其檢測方法，可對全血樣本中白細(xì)胞及病原體的核酸進(jìn)行快速提取，提取的核酸可直接用于PCR擴(kuò)增或熒光PCR檢測，也可置于-20℃長期保存。
【IPC分類】C12N15-10, C12Q1-68
【公開號】CN104611324
【申請?zhí)枴緾N201410251359
【發(fā)明人】張欽, 張平, 周正峰, 朱坤
【申請人】南京美寧康誠生物科技有限公司
【公開日】2015年5月13日
【申請日】2014年6月9日