一種使用同一菌株cgmcc 1593發(fā)酵耦合制備乳酸和丁二酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]—種使用同一菌株CGMCC 1593發(fā)酵稱合制備乳酸和丁二酸的方法,本發(fā)明利用微生物發(fā)酵實現(xiàn)乳酸和丁二酸的生產(chǎn)，實現(xiàn)使用同一菌株，將有氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵兩種工藝耦合的方法。屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]丁二酸(succinic acid)又名琥珀酸，廣泛存在于生物體中，是一種重要的二元有機羧酸，也是微生物三羧酸循環(huán)糖酵解途徑的重要代謝產(chǎn)物。丁二酸在很多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，可用于合成可降解塑料，醫(yī)藥領(lǐng)域的鎮(zhèn)定劑，食品工業(yè)的食品添加劑，表面活性劑等。因此，丁二酸的高效、低成本的生產(chǎn)方法成為近年來研究的熱點。
[0003]乳酸是世界公認三大有機酸之一。L-乳酸被認為是安全的食品添加劑，可以在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用，也是可完全生物降解塑料聚乳酸的主要原料。
[0004]目前，使用琥拍酸放線桿菌(Actinobacillussuccinogenes) CGMCC 1593 厭氧發(fā)酵進行丁二酸的制備是一種非?？煽康母咝У姆椒āＨ欢?，制備過程中為確保整個發(fā)酵過程的厭氧環(huán)境，需要不間斷的通入二氧化碳，造成了發(fā)酵成本的提高。
[0005]CN101613722A公開了一種使用纖維素為原料生產(chǎn)乙醇，同時實現(xiàn)丁二酸的發(fā)酵生產(chǎn)，過程中是將乙醇發(fā)酵過程中產(chǎn)生的二氧化碳通入丁二酸的發(fā)酵罐中，實現(xiàn)丁二酸發(fā)酵成本的降低。
[0006]過程中對于二氧化碳的高效利用是非常有利的，在降低丁二酸發(fā)酵成本的同時降低了碳排放。然而，由于乙醇發(fā)酵和丁二酸發(fā)酵使用的是完全不同的兩種菌，極易引起染菌，造成發(fā)酵過程的失敗，和更大的成本的增加。這種做法在實踐生產(chǎn)中實施起來的難度較高，風(fēng)險加大，不適合工業(yè)方法使用。
[0007]發(fā)明者在實驗過程中發(fā)現(xiàn)CGMCC 1593在不同的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件下，可以產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。這本身并不難理解，由于CGMCC 1593取自動物腸道菌群，屬于野生菌，其體內(nèi)存在多種基因和代謝途徑，生存環(huán)境變化就會產(chǎn)生不同的代謝產(chǎn)物。
[0008]特別是在調(diào)整培養(yǎng)基組成和發(fā)酵時通入一定量空氣后，CGMCC 1593即可產(chǎn)生乳酸，同時尾氣產(chǎn)生二氧化碳；恢復(fù)原有的培養(yǎng)基配方，并通入二氧化碳后，CGMCC 1593即可正常代謝丁二酸。上述發(fā)現(xiàn)，為實現(xiàn)使用同一菌株，改變不同的生存環(huán)境，即可實現(xiàn)不同的代謝產(chǎn)物以及兩個發(fā)酵過程的結(jié)合。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的在于提供一種使用同一菌株CGMCC 1593實現(xiàn)高產(chǎn)乳酸和丁二酸的方法，
本發(fā)明的技術(shù)方案:一種使用同一菌株CGMCC 1593發(fā)酵稱合實現(xiàn)高產(chǎn)乳酸和丁二酸的方法，所用出發(fā)菌株為琥拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)CGMCC 1593,在有氧發(fā)酵系統(tǒng)中在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加亞硫酸鈉0.2-0.5g/L，乙酸銨l~5g/L，同時通入無菌空氣，通入量為發(fā)酵總體積的0.19^0.5%/min，發(fā)酵制備乳酸；在厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加乙酸鈉l~5g/L，通入二氧化碳含量大于50%的有氧發(fā)酵系統(tǒng)的排放尾氣，尾氣通入量為0.5~5L/min，發(fā)酵制備丁二酸。
[0010]進行有氧發(fā)酵制備乳酸時，有氧發(fā)酵系統(tǒng)培養(yǎng)基組成如下:
種子培養(yǎng)基:蛋白胨5g/L，玉米漿20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鈉1.5g/L,酵母膏5g/L,用去離子水配制。
[0011]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨5g/L，玉米漿10g/L，葡萄糖120g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，磷酸氫二鈉2.5g/L,酵母膏5g/L,亞硫酸鈉0.2-0.5g/L,乙酸銨I ~5g/L,用去離子水配制。
[0012]無菌空氣通入量為發(fā)酵總體積的0.1%~0.5%/min,過程中流加lmol/L氫氧化鈉溶液，調(diào)控PH值。
[0013]進行厭氧發(fā)酵制備丁二酸時，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)培養(yǎng)基組成如下:
種子培養(yǎng)基:蛋白胨5g/L，玉米漿20g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氫鉀1.5g/L，磷酸氫二鈉1.5g/L,酵母膏5g/L,用去離子水配制。
[0014]發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨5g/L，玉米漿10g/L，葡萄糖100g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L，磷酸氫二鈉2.5g/L,酵母膏5g/L,乙酸鈉I ~5g/L,用去離子水配制。
[0015]有氧發(fā)酵系統(tǒng)尾氣通入量為0.5~5L/min,過程中流加lmol/L氫氧化鈉溶液,調(diào)控pH值。
[0016]根據(jù)實驗結(jié)果，為使有氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)生乳酸，需要添加亞硫酸鈉0.2-0.5g/L，乙酸銨l~5g/L，并且通入0.5~5L/min無菌空氣。在上述條件下，系統(tǒng)使用的CGMCC 1593在發(fā)酵過程中的代謝產(chǎn)物為L-乳酸，發(fā)酵尾氣中含有大量的二氧化碳。
[0017]亞硫酸鈉和乙酸銨的使用可以改變CGMCC1593的代謝途徑。而丁二酸的制備時，則是添加乙酸鈉。
[0018]按照有氧發(fā)酵系統(tǒng)培養(yǎng)基組成配制培養(yǎng)基，并在121°C下滅菌20min，種子一級為TSB培養(yǎng)液，培養(yǎng)14h后接種子培養(yǎng)基，接種量4%，種子培養(yǎng)達到7h后，將培養(yǎng)液接入有氧發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵罐中，接種量10%。
[0019]同時按照厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的培養(yǎng)及組成配制培養(yǎng)基，并在121°C下滅菌20min，種子一級為TSB培養(yǎng)液，培養(yǎng)14h后接種子培養(yǎng)基，接種量4%，種子培養(yǎng)達到7h后，將培養(yǎng)液接入?yún)捬醢l(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵罐中，接種量10%。等待有氧發(fā)酵系統(tǒng)尾氣排放的二氧化碳含量大于50%時，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中通入有氧發(fā)酵系統(tǒng)尾氣。
[0020]發(fā)酵過程中使用氫氧化鈉維持兩個發(fā)酵系統(tǒng)的pH值為5.5~6.5，最優(yōu)控制在6.0~6.2，溫度為37~39°C，發(fā)酵時間為48h，最終乳酸產(chǎn)量為60~70g/L，丁二酸產(chǎn)量為75~80g/Lo
[0021 ] 檢測方法使用液相色譜檢測。
[0022]本發(fā)明的有益效果:使用同一種菌株CGMCC 1593在不同的培養(yǎng)基和不同的氧氣含量的環(huán)境中實現(xiàn)不同的代謝產(chǎn)物的同時，將有氧發(fā)酵系統(tǒng)所產(chǎn)生的二氧化碳作為厭氧發(fā)酵系統(tǒng)所需要的惰性氣體，從而實現(xiàn)發(fā)酵成本的節(jié)省，降低碳排放。同時，大大降低了兩個系統(tǒng)的染菌風(fēng)險，特別是厭氧發(fā)酵的系統(tǒng)。即便有氧發(fā)酵系統(tǒng)出現(xiàn)異常，菌體進入?yún)捬醢l(fā)酵系統(tǒng)，也不會對后續(xù)系統(tǒng)產(chǎn)生任何影響，因為前后系統(tǒng)使用的是同一菌株。
【附圖說明】
[0023]圖1本發(fā)明方法流程示意圖。1、有氧發(fā)酵系統(tǒng)，2、厭氧發(fā)酵系統(tǒng)，3、有氧發(fā)酵系統(tǒng)的尾氣管線直接通入?yún)捬醢l(fā)酵系統(tǒng)中，4、無菌空氣通入。
【具體實施方式】
[0024]實施例1
本發(fā)明所用菌株琥拍酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes) CGMCC 1593,已在