96, Bioconjy gate Techniques，Academic Press)、美國(guó)6, 180, 084和美國(guó)6, 264, 914描述，以引用的方式將它 們整體并入本文；并包括例如應(yīng)用免疫學(xué)中常規(guī)使用的用于將半抗原連接至載體蛋白的方 法（參見Harlow和 Lane，1988，"Antibodies:A laboratory manual，'，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。在一些情況下，認(rèn)識(shí)到HB膚和/或治療蛋 白或治療肽在綴合后可能失去功效或功能，這取決于例如綴合過(guò)程或綴合過(guò)程中使用的化 學(xué)基團(tuán)。然而，考慮到存在大量綴合方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠找到不影響或最低限度影響 實(shí)體（例如待綴合的HB肽和治療肽）的功效或功能的綴合方法。
[0100] 在一些實(shí)施方式中，可通過(guò)交聯(lián)將HB肽綴合至活性劑（X)。交聯(lián)試劑包括戊二醛 (GAD)、雙官能團(tuán)環(huán)氧乙烷（OXR)、乙二醇二縮水甘油醚（EGDE)、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)和 水溶性碳二亞胺（優(yōu)選1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC))。如本領(lǐng)域技術(shù) 人員所周知的，任何交聯(lián)化學(xué)（crosslinking chemistry)都可以使用，包括但不限于：硫 醚、硫酯、蘋果酰亞胺（malimide)和硫醇、胺-羧基、胺-胺和有機(jī)化學(xué)手冊(cè)中列出的其它 交聯(lián)化學(xué)，例如Elements of Organic Chemistry, Isaak and Henry Zimmerman Macmillan Publishing Co. , Inc. 866Third Avenue, New York, N. Y.10022〇
[0101] 將HB肽綴合至活性劑的其它連接方法包括但不限于：氨基己辣根過(guò)氧化物酶 (aminocaproic horse radish peroxidase (HRP))或異雙功會(huì)泛（heterobiofunctional)交 聯(lián)接頭（例如羰基反應(yīng)性和巰基反應(yīng)性交聯(lián)接頭）。異雙功能交聯(lián)劑通常包含兩種反應(yīng)基 團(tuán)，這兩種反應(yīng)基團(tuán)可在兩步驟或三步驟過(guò)程中偶聯(lián)至蛋白和其它大分子上的兩個(gè)不同官 能靶標(biāo)，這可限制通常與使用同雙功能交聯(lián)接頭相關(guān)的聚合的程度。此類多步方案可提供 對(duì)綴合物尺寸和組分摩爾比的有力控制。
[0102] 在一些實(shí)施方式中，如美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)US2002/0132990和 US2004/0023902(以引用的方式將它們整體并入本文）所公開的，使用魚精蛋白接頭將HB 肽綴合至核酸活性劑（例如RNAi試劑或miRNA試劑）。具體而言，當(dāng)接頭為魚精蛋白或魚 精蛋白類試劑時(shí)，描述與HB肽關(guān)聯(lián)的魚精蛋白的制備方法、試劑和參考文獻(xiàn)公開于美國(guó)臨 時(shí)申請(qǐng)60/957, 023和美國(guó)專利申請(qǐng)US2007/012152以及美國(guó)2010/0209440中，以引用的 方式將它們各自整體并入本文。在一些實(shí)施方式中，包括在本發(fā)明中使用的魚精蛋白接頭 含有 US 2010/0209440 中公開的 SEQ ID NO:l-SEQ ID NO :6。
[0103] 用于將本文所公開的HB肽與X (例如第一融合伴侶，例如治療蛋白或治療 肽）綴合的合適方法包括例如碳二亞胺綴合（Bauminger和Wilchek, 1980, Meth. Enzymol. 70 :151-159)。或者，可將部分偶聯(lián)至由 Nagy 等，Proc NProc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7269-7273(1996);以及 Nagy 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1794-1799(1998)所描 述的靶向試劑，以引用的方式將其各自并入本文?？墒褂玫牧硪痪Y合方法為例如高碘酸鈉 氧化后進(jìn)行適當(dāng)反應(yīng)物的還原性烷基化及戊二醛交聯(lián)。
[0104] 可使用各種不同接頭來(lái)將本文所公開的HB肽與X(例如第一融合伴侶，例如治療 蛋白或治療肽）綴合，例如但不限于：氨基己辣根過(guò)氧化物酶（HRP)或異雙功能交聯(lián)接頭 (例如羰基反應(yīng)性和巰基反應(yīng)性交聯(lián)接頭）。異雙功能交聯(lián)劑通常包含兩種反應(yīng)基團(tuán)，這兩 種反應(yīng)基團(tuán)可在兩步驟或三步驟過(guò)程中偶聯(lián)至蛋白和其它大分子上的兩個(gè)不同官能靶標(biāo)， 這可限制通常與使用同雙功能交聯(lián)接頭相關(guān)的聚合的程度。此類多步方案可提供對(duì)綴合物 尺寸和組分摩爾比的有力控制。
[0105] 在一些實(shí)施方式中，接頭為美國(guó)專利6, 165, 476、5, 856, 456 ;美國(guó)申請(qǐng) 2010/0063258 ;以及國(guó)際申請(qǐng)W02012/142515 (以引用的方式將它們各自整體并入本文）中 公開的免疫球蛋白鉸鏈區(qū)（hinge region)接頭。
[0106] 在一些實(shí)施方式中，如美國(guó)申請(qǐng)2010/0063258(以引用的方式將其整體并入本 文）所公開的，HB-X融合蛋白可在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中生產(chǎn)。
[0107] 示例性接頭序列包括例如：（i) IgA 1的膜長(zhǎng)亞型（membrane long isoform)的尾 部區(qū)域（tail region) (malL) :SCSVADWQMPPPYWLD LPQETLEEETPGAN(SEQ ID NO :43) ;(ii) IgA I的膜變異長(zhǎng)亞型的尾部區(qū)域（具有額外cys的malL) :SCCVADWQMPPPYVVLDLPQETLE EETPGAN(SEQ ID NO :44) IgA 1的膜短亞型的尾部區(qū)域（具有6個(gè)氨基酸的N端刪 除的mals):
[0108] DWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN(SEQ ID NO :45) ; (iv) IgA2 的膜結(jié)合形式的尾 部區(qū)域：SCCVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEE TPGAN(SEQ ID NO :46) ; (V) IgD 的膜結(jié)合形式 的尾部區(qū)域：YLA MTPLIPQSKDENSDDYTTFDDVGS(SEQ ID NO :47) ; (vi) IgE 的膜結(jié)合形 式的尾部區(qū)域：ELDVCVEEAEGEAPW (SEQ ID NO :48) ; (vii) IgG的膜結(jié)合形式的尾部區(qū) 域：ELQLEESCAEAQDGELDG(SEQIDN0:49) ;以及（viii)IgM的膜結(jié)合形式的尾部區(qū)域： EGEVSADEEGFEN(SEQ ID N0:50)。
[0109] 在其它實(shí)施方式中，接頭序列來(lái)源于分泌性或可溶性形式的免疫球 蛋白的尾部區(qū)段。示例性接頭序列包括例如：（i) IgAl的可溶性形式的尾部 區(qū)域：KPTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID N0:51) ;(ii)IgA2 的可溶性形式的尾部 區(qū)域：KPTHVNVSVVMAEVDGTCY(SEQ ID N0:52) ;(iii)IgD 的可溶性形式的尾部 區(qū)域：YVTDHGPMK(SEQ ID NO :53);以及（iv)IgM的可溶性形式的尾部區(qū)域： PTLYNVSLVMSDTAGTCY(SEQ ID N0:54)。
[oho] 在某些實(shí)施方式中，可期望具有含游離半胱氨酸殘基的接頭序列，以允許接頭之 間二硫鍵的形成，由此形成HB融合蛋白的二聚體。在其它實(shí)施方式中，可期望例如通過(guò)將 接頭中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基突變?yōu)榱硪粴埢ɡ缃z氨酸、丙氨酸或甘氨酸）來(lái)改 變接頭序列，以移除游離的半胱氨酸殘基。已進(jìn)行改變來(lái)移除游離半胱氨酸殘基的來(lái)源于 膜結(jié)合免疫球蛋白的尾部區(qū)域的接頭序列的實(shí)例包括：
[0111] (i)SXSVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN，其中，X 為絲氨酸、丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID NO :55) ; (ii) SXXVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN，其中，X 各自獨(dú)立地選自于絲氨酸、 丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID N0:56) ;(iii)SXXVADWQMPPPYVVLDLPQETLEEETPGAN，其中，X 各自 獨(dú)立地選自于絲氨酸、丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID N0:57) ;(iv)ELDVXVEEAEGEAPW，其中，X為 絲氨酸、丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID N0:58);以及（v)ELQLEESXAEAQDGELDG，其中，X為絲氨 酸、丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID NO :59)。已進(jìn)行改變來(lái)移除游離半胱氨酸殘基的來(lái)源于分 泌形式的免疫球蛋白的尾部區(qū)域的接頭序列的實(shí)例包括：（i)KPTHVNVSVVMAEVDGTXY，其中， X為絲氨酸、丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID N0:60) ;(ii)KPTHVNVSVVMAEVDGTXY，其中，X為絲氨 酸、丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID N0:61);以及（iii)PTLYNVSLVMSDTAGTXY，其中，X為絲氨酸、 丙氨酸或甘氨酸（SEQ ID NO :62)。
[0112] 待綴合至HB肽的活性劑-治療蛋白
[0113] 本文所述組合物的重要性和有用性由該組合物在軟骨修復(fù)的應(yīng)用中得到例證， 其中，融合蛋白為HB-IGF-1。關(guān)節(jié)的外傷性損傷（例如涉及前交叉韌帶（ACL)破裂的損 傷）導(dǎo)致發(fā)展出骨關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)增加。此外，這種風(fēng)險(xiǎn)可能無(wú)法通過(guò)手術(shù)修復(fù)功能來(lái)解決 (Lohmander等，35Am. J. Sports Med. 1756(2007))，這可能涉及關(guān)節(jié)損傷后的初始炎癥和分 解代謝反應(yīng)。Lohmander 等，42Arthritis Rheum. 534(1999) ;Lohmander 等，48Arthritis Rheum. 3130(2003) ;Irie等，IOKnee 93(2003)。在該時(shí)間段中的治療性干預(yù)可能對(duì)于對(duì)抗 這些分解代謝過(guò)程和促進(jìn)軟骨修復(fù)特別重要。
[0114] IGF-I為刺激軟骨生物合成的典型循環(huán)因子。Daughaday等，19J. Clin. Endocrinol. Metab. 743 (1959) ;McQuillan 等，240Biochem.J. 423 (1986); Jones&Clemmons，16Endocrine Rev. 3(1995)。它還作用于對(duì)抗代謝刺激。Luyten 等， 267Arch. Biochem. Biophys. 416 (1988) ;Tvler，260Biochem. J. 543 (1989)。結(jié)果，研究者 一直試圖將 IGF-I 用作軟骨修復(fù)的治療劑。Trippel，43J. Rheumatol. Suppl. 129(1995)。 但是，IGF-I和其它生長(zhǎng)因子的局部遞送嚴(yán)重受限于它們?cè)陉P(guān)節(jié)中的短半衰期。研究者已 經(jīng)開發(fā)了用IGF-I進(jìn)行基因治療的選項(xiàng)和封裝在水凝膠中的IGF-1，從而允許向關(guān)節(jié)軟骨 的長(zhǎng)期受控釋放。雖然有前景，這些技術(shù)卻遲遲沒有進(jìn)入臨床試驗(yàn)。Evans等，7Nat. Rev. Rheum. 244(2011)。
[0115] 不例大鼠 IGF-1蛋白具有以下氣基酸殘基：
[0116] GPETLCGAELVDALQFVCGPRGFYFNKPTGYGSSIRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPTKS A (SEQ ID NO :6)。參見例如 Tokunou 等，22FASEB J. 1886(2008)。
[0117] 示例人IGF-I具有以下氨基酸殘基：
[0118] GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKS ARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQIDN0:7) t)&SMGeneID:3489(AlGFl)Q3 - 示例人IGF-I (變體）具有以下氨基酸殘基序列：GPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSS RRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA. (SEQ ID NO :8)。具有生物活性的人 IGF-I 變體 (參見W092/03477 ;GenBank :CAA01451. 1)具有以下氨基酸殘基：
[0119] megpetIcgaelvdalqfvcgdrgfyfnkptgygsssrrapqtgivdeccfrscdlrrIemycapIkpa ksa(SEQ ID NO ：9)〇
[0120] 已知IGF-I的N末端截短（例如N末端氨基酸GPE的刪除）保留了生物活性。因 此，在一些實(shí)施方式中，包含于本發(fā)明中使用的人IGF-I (變體）具有以下氨基酸殘基序 列：
[0121] TLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA. (SEQ ID NO ：63).
[0122] 因此，在一些實(shí)施方式中，重組HB-接頭-HB-X融合蛋白（其中，HB是C16R變體， 所述接頭是GGG，以及X是SEQ ID NO :7的人IGF-I變體）具有以下氨基酸序列：
[0123] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVC⑶RG FYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRG SA(SEQ ID N0:10);另一重組HB-接頭-HB-接頭-HB-X(其中，HB是C16R變體，所述接頭 是GGG，以及X是人IGF-I變體（SEQ ID NO :7))可描述為：
[0124] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGGGKRKKKGKGL GKKRDPRLRKY KGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQ RHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID N0： 11).
[0125] 在一些實(shí)施方式中，SEQ ID NO :7的IGF-I變體可被替換為SEQ ID NO :8或SEQ ID NO :9。在一些實(shí)施方式中，HB C 16R(例如SEQ ID NO :2)可被替換為HB C17R(例如， MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYK;SEQ ID N0:21)。HB C 17R 與全長(zhǎng)人 IGF-USEQ ID N0:7 的 IGF-1)的示例融合體具有以下氨基酸：
[0126] MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDEC CFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID N0:12)。在一些實(shí)施 方式中，HB C16R與全長(zhǎng)人IGF-USEQ ID N0:7的IGF-1)的示例融合體（例如HB-IGF)具 有以下氨基酸：
[0127] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECC FRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID NO :16).
[0128] 在一些實(shí)施方式中，HB C16R(例如 SEQ ID NO :2)或 HB C17R(SEQ ID NO :21)可 被替換為HB C16K(SEQ ID NO :3)或HB C 17K(MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYK ;SEQ ID NO :22)。 例如，在另一實(shí)例中，HB C17K與全長(zhǎng)人IGF-I (例如SEQ ID NO :7)的融合體具有以下氨基 酸：
[0129] MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDEC CFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID N0:13)。融合至 HB C 17R的人IGF-I截短（對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :8)具有以下氨基酸序列：
[0130] MKRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDEC CFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID N0:14)或
[0131] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECC FRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID NO :18)，以及 HB C17K 與成熟的人 IGF-I 的融合體：
[0132] MKRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDEC CFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID N0:15)。
[0133] 可構(gòu)建缺少 HB 肽（例如包含 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2 或 SEQ ID NO :3 的 HB 肽）上的起始N末端甲硫氨酸的前述HB-融合蛋白的變體，S卩，KRKKKGKGLGKKRDPELRKYKGP ETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHT DMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID N0： 16)；
[0134] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECC FRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSARSVRAQRHTDMPKTQKEVHLKNASRGSA(SEQ ID N0:17);
[0135] KRKKKGKGLGKKRDPRLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECC FRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID N0:18);以及
[0136] KRKKKGKGLGKKRDPKLRKYKGPETLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECC FRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA(SEQ ID N0:19)·
[0137] 表I公開了 HB肽融合至試劑的不同實(shí)施方式的