用于治療癌癥的單克隆抗體的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請?zhí)枮?00980136101.9的中國專利申請的分案申請，原申請是2009 年9月16日提交的PCT國際申請PCT/EP2009/006704于2011年3月15日進入中國國家 階段的申請。
技術(shù)領域
[0002] 本發(fā)明涉及用于治療癌癥的單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0003] 基于抗體的癌癥療法已被成功地引入臨床中，并已在過去十年中成為腫瘤學中最 具有前景的療法。
[0004] 與傳統(tǒng)藥物相比，基于抗體的癌癥療法具有較高特異性和較低副作用等潛力。究 其原因是抗體能夠精確地區(qū)分正常和腫瘤細胞，并且它們的作用模式依賴于毒性較低的免 疫抗腫瘤機制，例如補體活化和細胞毒性免疫細胞的招募。
[0005] 基于抗體之療法的靶標需要具有特別的性質(zhì)，所述性質(zhì)形成了正確區(qū)分正常細胞 和腫瘤細胞的基礎。顯然，僅存在于腫瘤細胞中并在正常組織中完全檢測不到的靶標對于 開發(fā)有效且安全的抗體療法來說是理想的。另一方面，高水平過表達可作為治療窗的基礎 并且副作用低，例如人類2型表皮生長因子受體（HER-2)作為基因擴增的結(jié)果，其是抗體曲 妥珠單抗（trastuzumab)(赫賽?。℉erceptin))的良好革巴標。
[0006] 用于腫瘤治療的已經(jīng)批準或在臨床開發(fā)中的抗體的其它靶標具有不同的性質(zhì)，它 們并非基于腫瘤細胞上靶分子的大量過表達。在針對蛋白聚糖MUC-1的抗體的情形中，該 靶標之骨架的肽重復表位在腫瘤細胞中糖基化不足，并因此與其正常對應物不同。在針對 CD20(利妥昔單抗（rituximab))、CD52(坎帕斯-lH(Campath-lH))和 CD22(依帕珠單抗 (epratuzumab))的抗體的情形中，抗體祀標在腫瘤細胞和正常淋巴細胞上具有類似的表達 水平。此時，由于靶標陰性的干細胞恢復了正常淋巴細胞群，因此利用抗體剔除正常細胞 是可耐受的?？贵w靶標可接近性具有差異的另一些實例包括癌胚抗原（CEA)和碳酸酐酶 IX(CA9)。這兩種抗原均分別表達于結(jié)腸和腎的正常上皮細胞上。然而，放射性標記的成像 抗體能夠很好地區(qū)分腫瘤組織與正常組織，并且細胞毒性抗體耐受良好。這極有可能是由 于CA9和CEA限制性表達在正常上皮組織的腔室一側(cè)（IgG抗體沒有機會接近此處）所致。 同樣地，抗原上皮細胞粘附分子（Ep-CAM)屬于這一類。作為上皮細胞的同型細胞粘附分 子，其定位于細胞間隙。令人感興趣的是，由于高親合力的抗Ep-CAM抗體毒性很強，因此中 等親合力的抗體耐受良好。這提示可接近正常細胞上的Ep-CAM靶標，同時還表明抗體結(jié)合 動力學可拓展治療的領域。
[0007] 已有八種抗體被批準用于治療腫瘤疾病，其中大多數(shù)為淋巴瘤和白血?。ˋdams， G. P. &Weiner，L. M. (2005) Nat. Biotechnol. 23,1147-1157)。只有 3 種單克隆抗體（mAb)(即 赫賽汀，阿瓦斯?。ˋvastin)和愛必妥（Erbitux))解決了占癌癥誘發(fā)死亡率90%以上的實 體癌問題。醫(yī)療中的大批需要、已提供的經(jīng)批準mAb的明顯臨床有益效果及其巨大的商業(yè) 成功均激發(fā)了開發(fā)針對更廣患者群的基于抗體之治療以及提高其療效的創(chuàng)新方法的一輪 浪潮（Brekke，0? H. &Sandlie，I. (2003)Nat. Rev. Drug Discov. 2,52-62 ;Carter，P. (2001) Nat. Rev. Cancer 1,118-129)〇
[0008] 開發(fā)下一代升級的基于抗體之癌癥療法所面臨的一個挑戰(zhàn)是選擇合適的靶標分 子，這是有利的毒性/功效模式的關鍵所在。
[0009] 對于目前可用于治療實體癌的抗體（由于其靶標表達在正常組織上所致）來說， 尚未充分發(fā)掘出抗體分子作用模式的全部潛能。例如，赫賽汀的祀標Her2/neu表達于許 多正常的人體組織中，包括心?。–rone, S.A.，Zhao, Y.Y.，F(xiàn)an, L.，Gu，Y.，Minamisawa， S. , Liu, Y. , Peterson, K. L. , Chen, J. , Kahn, R. , Condorelli, G?等（2002)Nat. Med. 8， 459-465)。因此，所設計的赫賽汀具有減低的免疫效價，并且不能以最高有效劑量給藥，否 則將出現(xiàn)不能承受的毒性。這種"使具有鋒利潛力的刀變鈍"限制了赫賽汀的療效。
[0010] 除了不在毒性相關的正常組織中表達以外，在腫瘤細胞表面上穩(wěn)健且大量表 達以及表現(xiàn)出促進腫瘤的功能是理想的抗體祀標的期望特征（Houshmand，P. &Zlotnik， A. (2003)Curr. Opin. Cell Biol. 15,640-644)〇
[0011] 為了發(fā)現(xiàn)用于抗體治療癌癥的新靶標，我們使用綜合數(shù)據(jù)挖掘和實驗驗證方法鑒 定出GT468。GT468是胎盤特異性基因，其在多種腫瘤特別是乳腺癌中往往異常活化并高度 表達。在MCF-7和BT-549乳腺癌細胞中，RNAi介導的GT468沉默顯著破壞了運動、遷移和 侵入，并誘導G1/S細胞周期阻滯使增殖幾乎完全受阻。GT468的敲低與細胞周期蛋白D1的 表達減少相關，并降低了 AKT激酶的磷酸化。此外，GT468位于癌細胞的表面上，其對于拮 抗該分子之生物功能的抗體來說是可接近的。
[0012] GT468具有使其成為極具吸引力的治療性抗體之靶標的若干特性。作為僅在如懷 孕這樣的特別時期才在人體中出現(xiàn)的細胞譜系分化抗原，它在健康的毒性相關組織中不存 在，如同自身抗原可能的情形一樣。它在多種腫瘤實體中的高普遍性使眾多患者可以采用 GT468靶向療法來治療。例如在乳腺癌的情形中，82%的患者攜帶該靶標。相反地，赫賽汀 的靶標Her2/neu(唯一可用于治療這種癌癥類型的mAb)僅在20-25%的乳腺癌患者中過表 (Slamon, D. J. , Godolphin, ff. , Jones, L. A. , Holt, J. A. , Wong, S. G. , Keith, D. E. , Levin, W.J.，Stuart, S.G.，Udove，J.，Ullrich, A?等（1989) Science 244,707-712)。對于 GT468 分別在42%和58%的病例中表達的肺癌和胃癌來說，由于這些癌癥類型缺少合適的靶標， 到目前為止尚無經(jīng)批準的mAb療法。
[0013] 可將針對活細胞上GT468之抗體用于開發(fā)成藥物，這種抗體可表現(xiàn)出抗腫瘤效果 例如增殖抑制。GT468不僅參與增殖，而且還參與細胞的運動、遷移和侵入。最令人感興趣 的是，所有這些屬性不僅充分造就了腫瘤表型，而且還是人滋養(yǎng)層細胞的固有特性，所述滋 養(yǎng)層細胞的生理特征是生長快速并且有效侵入子宮組織。預期可對GT468的mAb進行改造， 使其以最大潛力地迅速介入所有這些作用來介導免疫效應功能（例如ADCC和⑶C)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明一般地提供可用作治療和/或預防與表達GT468和/或特征在于其細胞 表面與GT468締合之疾病的抗體，所述疾病包括腫瘤相關疾病例如癌癥，尤其是乳腺癌、肺 癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、食道癌、頭頸癌、腎癌（尤其是腎細胞癌）、前 列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、神經(jīng)母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及 其轉(zhuǎn)移形式。在一個實施方案中，所述癌癥疾病是肺中的轉(zhuǎn)移癌。
[0015] 一方面，本發(fā)明涉及能夠與GT468結(jié)合的抗體。本文所述的抗體優(yōu)選地是分離的 單克隆抗體，所述抗體特異性地與GT468上存在的表位結(jié)合，優(yōu)選地與GT468的細胞外結(jié)構(gòu) 域中的表位結(jié)合，更優(yōu)選地與SEQ ID N0 :3-10和35-82結(jié)合。優(yōu)選地，所述抗體能夠與位 于細胞表面的GT468結(jié)合，優(yōu)選地與位于GT468細胞外結(jié)構(gòu)域的一個或多個表位（優(yōu)選地 在GT468的23-212位氨基酸殘基中）結(jié)合，最優(yōu)選地與位于SEQ ID N0 :3-10和35-82氨 基酸序列之一中的表位結(jié)合。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述抗體對SEQ ID N0 :3-10和 35-82氨基酸序列之一個或多個具有特異性。在多個實施方案中，所述抗體能夠結(jié)合包含 SEQ ID N0 :2的29至119位氨基酸的肽，優(yōu)選29至212位氨基酸，更優(yōu)選23至212位氨 基酸。
[0016] 本發(fā)明所包括的單克隆抗體包括IgA、IgGl-4、IgE、IgM和IgD抗體。在一個實施 方案中，抗體是IgGl抗體，更尤其是IgGl、K同種型或IgGl、X同種型。在另一個實施方 案中，抗體是IgG3抗體，更尤其是IgG3、K同種型或IgG3、X同種型。在又一個實施方案 中，抗體是IgG4抗體，更尤其是IgG4、K同種型或IgG4、X同種型。還在另一個實施方案 中，抗體是IgAl或IgA2抗體。還在另一個實施方案中，抗體是IgM抗體。
[0017] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種或多種根據(jù)SEQ ID N0 :75-79的肽。 在一個實施方案中，抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0:75的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0:76的肽，更優(yōu) 選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :75的肽和根據(jù)SEQ ID N0 :76的肽。在另一個實施方案中，抗體 結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :77的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0 :78的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0 :79的 肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0:78的肽和根據(jù)SEQ ID N0:79的肽，或結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO : 77的肽、根據(jù)SEQ ID NO :78的肽和根據(jù)SEQ ID NO : 79的肽。
[0018] 在一個實施方案中，使用根據(jù)SEQ ID NO :4的肽或根據(jù)SEQ ID NO :80的肽進行免 疫，獲得本發(fā)明的抗體。在另一個實施方案中，使用根據(jù)SEQ ID N0 :6的肽或根據(jù)SEQ ID NO :81的肽進行免疫，獲得本發(fā)明的抗體。優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種或多種所述肽。 [0019] 在又一個實施方案中，使用根據(jù)SEQ ID N0 :4的肽或根據(jù)SEQ ID N0 :80的肽進行 免疫，獲得下述抗體，所述抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0:75的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0:76的 肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO :75的肽和根據(jù)SEQ ID NO :76的肽。在另一個實施方案 中，使用根據(jù)SEQ ID N0 :6的肽或根據(jù)SEQ ID N0 :81的肽進行免疫，獲得下述抗體，所述抗 體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :77的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0 :78的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0 :79 的肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO :78的肽和根據(jù)SEQ ID NO :79的肽或結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO : 77的肽、根據(jù)SEQ ID NO :78的肽和根據(jù)SEQ ID NO : 79的肽。
[0020] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種或多種根據(jù)SEQ ID NO :61-66的肽。 在一個實施方案中，抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO :61的肽和/或根據(jù)SEQ ID NO :62的肽，更 優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :61的肽和根據(jù)SEQ ID N0 :62的肽。在另一個實施方案中，抗 體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :64的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0 :65的肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO :64的肽和根據(jù)SEQ ID NO :65的肽。在另一實施方案中，抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO :65 的肽和/或根據(jù)SEQ ID NO :66的肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO :65的肽和根據(jù)SEQ ID NO :66的肽。
[0021] 在一個實施方案中，使用根據(jù)SEQ ID NO :82的肽進行免疫，獲得本發(fā)明的抗體。 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體結(jié)合所述肽。根據(jù)SEQ ID N0 :82的肽具有C-端GS-連接子，所述連 接子被添加以幫助肽的1和16位氨基酸之間二硫鍵的形成。推測所述肽與GT468的天然 構(gòu)象相似。由使用SEQ ID N0 :82的肽進行免疫獲得的雜交瘤51-1A-1所生產(chǎn)的抗體對表 達GT468的癌細胞的增殖和集落形成顯示強抑制活性。
[0022] 在又一個實施方案中，使用根據(jù)SEQ ID N0 :82的肽進行免疫，獲得下述抗體，所述 抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :64的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0 :65的肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :64的肽和根據(jù)SEQ ID N0 :65的肽，或者所述抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :65的肽和/ 或根據(jù)SEQ ID N0:66的肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0:65的肽和根據(jù)SEQ ID N0:66的 肽。
[0023] 在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體結(jié)合一種或多種根據(jù)SEQ ID N0 :57_60的肽。在 一個實施方案中，抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :57的肽和/或根據(jù)SEQ ID N0 :58的肽和/或 根據(jù)SEQ ID N0 :59的肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0 :57的肽和根據(jù)SEQ ID N0 :58的 肽和根據(jù)SEQ ID N0:59的肽。在另一個實施方案中，抗體結(jié)合根據(jù)SEQ ID N0:59的肽和 /或根據(jù)SEQ ID NO :60的肽，更優(yōu)選地結(jié)合根據(jù)SEQ ID NO :59的肽和根據(jù)SEQ ID NO :60 的肽。
[0024] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體與癌細胞結(jié)合，尤其是本文所述之癌癥類型的細胞，優(yōu)選不 與非癌細胞顯著結(jié)合，更優(yōu)選地不與除胎盤細胞和睪丸細胞之外的非癌細胞顯著結(jié)合。優(yōu) 選地，所述抗體與表達GT468和/或特征在于其細胞表面與GT468締合之細胞（例如癌細 胞）的結(jié)合介導殺死所述細胞和/或抑制該細胞的一種或多種活性（例如運動、遷移、侵 入、增殖和集落形成）。優(yōu)選地，抗體抑制所述細胞的增殖和/或集落形成。
[0025] 本發(fā)明的抗體殺死細胞和/或抑制細胞的一種或多種活性（尤其是細胞增殖和/ 或集落形成）優(yōu)選地通過該抗體與所述細胞表達的GT468結(jié)合和/或與所述細胞的細胞表 面相互作用來誘導。這樣殺死細胞和/或抑制細胞的一種或多種活性可用于本文所述的治 療中。具體而言，殺死細胞和/或抑制細胞增殖和/或抑制細胞集落形成可用于治療或預 防癌癥，包括癌癥轉(zhuǎn)移。抑制細胞的運動、遷移、侵入、增殖和/或集落形成可尤其用于治療 或預防癌癥轉(zhuǎn)移和癌細胞轉(zhuǎn)移性傳播。
[0026] 優(yōu)選地，所述表達GT468和/或特征在于其細胞表面與GT468締合的細胞是癌細 胞，尤其選自以下癌癥疾病的致瘤性癌細胞：乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、肝細胞癌、結(jié)腸 癌、胰腺癌、食管癌、頭頸癌、腎癌（尤其是腎細胞癌）、前列腺癌、肝癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓 瘤、神經(jīng)母細胞瘤、胎盤絨毛膜癌、宮頸癌和甲狀腺癌，及其轉(zhuǎn)移形式。在一個實施方案中， 所述癌癥疾病是肺中的轉(zhuǎn)移癌。
[0027] 本發(fā)明的抗體可附著至一種或多種治療效應物部分（therapeutic effector moieties)，例如放射性標簽、細胞毒素、治療性酶、誘導凋亡的試劑等等，從而提供定向的 細胞毒性，即殺死腫瘤細胞。
[0028] 優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體通過誘導補體依賴性細胞毒作用（CDC)介導的裂解、抗體 依賴性細胞毒作用（ADCC)介導的裂解、細胞凋亡、同質(zhì)性粘附（homotypic adhesion)和/ 或吞噬作用（優(yōu)選地通過誘導CDC介導的裂解和/或ADCC介導的裂解）來殺死細胞。然 而，本發(fā)明還包括下述實施方案，其中抗體發(fā)揮其如本文所述的活性，如殺死細胞和/或抑 制細胞的一種或多種活性，例如細胞增殖和/或集落形成，而不誘導補體依賴性細胞毒性 (CDC)介導的裂解、抗體依賴性細胞毒作用（ADCC)介導的裂解、凋亡、同型粘附和/或吞噬 作用。例如，本發(fā)明的抗體也可簡單地通過與細胞表面上的GT468結(jié)合而發(fā)揮作用，從而例 如阻斷細胞的增殖。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體不誘導CDC介導的細胞裂解。
[0029] 優(yōu)選地，ADCC介導的細胞裂解在效應細胞（在一些具體實施方案中選自單核細胞 (monocyte)、單個核細胞（mononuclear cell)、NK細胞和PMN)存在時發(fā)生，而吞噬作用由 巨噬細胞實現(xiàn)。
[0030] 在一個尤其優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體具有抑制或降低表達GT468和/或 特征在于其細胞表面與GT468締合之細胞（優(yōu)選癌細胞如乳腺癌細胞）增殖的活性。可以 在使用溴脫氧尿苷（5-溴-2-脫氧尿苷，BrdU)的實驗中，通過測定表達GT468的癌細胞的 增殖來體外測量這一活性。BrdU是合成的核苷，其為胸苷的類似物并且可以在DNA復制期 間代替胸苷，摻入正在復制的細胞（細胞周期的S期）新合成的DNA中。使用例如對BrdU 具有特異性的抗體檢測所摻入的化學品，這指示了活躍地復制其DNA的細胞?？梢允褂眉?胞系 BT-549、Caov-3、EF0-21、SK-BR-3、MCF-7、MDA-MB-468 和 MDA-MB-231 作為表達 GT468 的癌細胞。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的抗體抑制或降低細胞系SK-BR-3、MCF-7和 MDA-MB-468中一種或多種的增殖，優(yōu)選地抑制或降低細胞系SK-BR-3和MCF-7二者的增 殖，最優(yōu)選地抑制或降低SK-BR-3、MCF-7和MDA-MB-468全部細胞系的增殖。在這一方面中 優(yōu)選的本發(fā)明抗體選自：（i)由雜交瘤 35-48B-l、35-50A-2a、38-10B-l、38-lA-l、45-2A-l、 45-8A-2、48-3B-l、48-4A-l、49-3A-l、51-lA-l、53-13A-2、53-29Al、56-4A-2、62-