抗人癌胚抗原抗體及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗人癌胚抗原抗體及其編碼基因和 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤標(biāo)志物（Tumor Marker)是反映腫瘤存在的化學(xué)類物質(zhì)。它們或不存在于正 常成人組織而僅見于胚胎組織，或在腫瘤組織中的含量大大超過在正常組織里的含量，它 們的存在或量變可以提示腫瘤的性質(zhì)，借以了解腫瘤的組織發(fā)生、細(xì)胞分化、細(xì)胞功能，以 幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷以及治療指導(dǎo)。
[0003] 在與惡性腫瘤的斗爭中，醫(yī)生、患者和家屬往往最關(guān)心的是如何盡早發(fā)現(xiàn)腫瘤的 產(chǎn)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移。X線診斷機、CT機、MRI機等診斷儀器和技術(shù)的發(fā)展，使得目前已能夠發(fā) 現(xiàn)直徑> 5mm的腫瘤，對早期檢出腫瘤和評價治療效果、幫助醫(yī)生修改治療方案提供了有 力的支持。但是，仍然有一部分腫瘤的"殘渣余孽"因為其體積太小或位于體內(nèi)特殊位置而 難以被識別出來，這些"漏網(wǎng)之魚"在暗處悄悄長大，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，最終奪去了不少 患者的生命。那么，有沒有其他辦法幫助識別出這些潛在的威脅呢？答案就是一類重要指 標(biāo)，即目前在臨床診治中廣泛應(yīng)用的"腫瘤標(biāo)記物"。它們是一類能通過化驗血液、尿液或腫 瘤組織查出、并反映體內(nèi)腫瘤情況的物質(zhì)，與以上所述的影像學(xué)形態(tài)檢查方法相比，可稱之 為"無形表象"，是對形態(tài)診斷的有力補充。
[0004] 廣義來說，腫瘤標(biāo)記物是某些腫瘤細(xì)胞上存在或分泌、排出到體液中的物質(zhì)，可大 致分為腫瘤細(xì)胞分泌物和腫瘤細(xì)胞表達(dá)物兩類。前者是腫瘤細(xì)胞在發(fā)生、發(fā)展中產(chǎn)生的物 質(zhì)，腫瘤生長越旺盛、其量越多，反之，腫瘤生長被壓制、其產(chǎn)生量也減少。這些物質(zhì)往往是 糖蛋白，可以通過檢驗血等體液查出并進行監(jiān)測。目前常用的有肺癌腫瘤標(biāo)記物群（CEA、 Cyfra21-1、NSE 等）、消化道腫瘤標(biāo)記物群（CEA、CA199、CA242、CA724 等）、CA153 (乳腺癌 等）、CA125 (卵巢癌等）、AFP (肝癌等）、PSA (前列腺癌等）、HCG (絨癌等）[Tannous BA， Teng J(2011) "Secreted blood reporters ：Insights and applications"Biotechnol Adv. 29(6) :997_1003 ;Khunger M，Kumar U，Roy HK，Tiwari AK. (2014) "Dysplasia and cancer screening in21st century. ''APMIS 122(8) :674_682 ;Grunnet M? Mau- Sorensen M. (2014) "Serum tumor markers in bile duct cancer-a review. ''Biomarkers 19(6)： 437-443 ；Napier KJ， Scheerer M， Misra S. (2014) "Esophageal cancer ：A Review of epidemiology，pathogenesis，staging workup and treatment modalities. ''World J Gastrointest Oncol 6(5) :112_120. ]D它們往往在腫瘤很小時即可被檢測出來，有助于早 期發(fā)現(xiàn)病灶；則提示療效可能不佳；如手術(shù)切除腫瘤一段時間后標(biāo)記物進行性升高，則往 往提示體內(nèi)可能已經(jīng)有腫瘤細(xì)胞增殖、生長，如在治療后明顯降低，則提示治療有效，反之， 需嚴(yán)密監(jiān)視。
[0005] 因此，有經(jīng)驗的腫瘤科醫(yī)生往往會在對患者做影像檢查、評估瘤體大小的同時抽 血檢查、動態(tài)觀察相應(yīng)標(biāo)記物，以了解腫瘤生長是否仍然活躍、治療后其活性是否被抑制 等。它們的特點是反映靈敏、往往能早于CT、MRI等手段早期判斷腫瘤生長狀態(tài)，提醒醫(yī)生 是否需要更換治療方案；弱點是準(zhǔn)確性較低、不如影像學(xué)診斷可靠，所以，往往需要共同檢 驗幾個標(biāo)記物、動態(tài)觀察其變化、并結(jié)合其他臨床表征做出判斷。腫瘤標(biāo)志物檢測臨床上常 用于：（1)早期預(yù)警腫瘤發(fā)生、發(fā)展；（2)動態(tài)監(jiān)測以反映治療效果；（3)在無法取得腫瘤標(biāo) 本、明確病理診斷時對腫瘤性質(zhì)做出某些提示、為試驗性治療提供參考依據(jù)。
[0006] 人癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA)是一種酸性糖蛋白，可廣泛存在 于內(nèi)胚葉起源的消化系統(tǒng)癌，也存在于正常胚胎的消化管組織中，最初發(fā)現(xiàn)于結(jié)腸癌和胎 兒腸組織中，故名癌胚抗原。癌胚抗原是在胚胎時胃腸道、肝、胰腺合成的一種蛋白質(zhì)。在 成年人胃腸道中也有少量合成，但不進入血液系統(tǒng)而是通過胃腸道排出，因此，在正常成年 人血清中只有微量的癌胚抗原。
[0007] 癌胚抗原是一個廣譜性腫瘤標(biāo)志物，它能向人們反映出多種腫瘤的存在，CEA升 高常見于大腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、膽管癌、乳腺癌、卵巢、甲狀腺髓樣癌和泌尿系 統(tǒng)的腫瘤[Grunnet M，Sorensen JB. (2012) "Carcinoembryonic antigen (CEA) as tumor marker in lung cancer. " Lung Cancer 76(2) : 138-43 ;Nagai Y，Beppu T，Sakamoto Y， et al. (2014) "Carcinoembryonic Antigen Half-life Is an Early Predictor of Therapeutic Effects in Induction Chemotherapy for Liver Metastases from Colorectal Cancer. ''Anticancer Res. 34(10) :5529_35;Chao YJ，Sy ED，Hsu HP，Shan YS. (2014) "Predictors for resectability and survival in locally advanced pancreatic cancer after gemcitabine-based neoadjuvant therapy. " BMC Surg.14 ： 72.]。此外，對大腸癌、乳腺癌和肺癌的療效判斷、病情發(fā)展、監(jiān)測和預(yù)估計，CEA也是一個 較好的腫瘤標(biāo)志物。
[0008] 癌旁正常粘膜CEA含量很少或為陰性。以胃癌為例，胃癌的CEA陽性率為85. 58%; 而其中胃粘液腺癌及印戒細(xì)胞癌（又稱粘液細(xì)胞癌）的CEA陽性率為100% [Chung JK， Lee MC，Chung HK，Lim SM，Jang JJ，Koh CS(1995) "Concentration and distribution of tumor associated antigens TAG-72and CEA in stomach cancer. ''Ann Nucl Med. 9 (1)： 7-13.]。癌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)CEA含量較多的原因與癌細(xì)胞CEA合成增加及CEA排出受阻有關(guān)。當(dāng) 癌細(xì)胞變性壞死時，細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)受損破裂，CEA可出現(xiàn)在胞質(zhì)的基質(zhì)內(nèi)。粘液細(xì)胞癌CEA 分布在整個細(xì)胞膜和胞漿的膜結(jié)構(gòu)中，CEA抗原決定基為糖蛋白，而腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移 均與細(xì)胞膜糖蛋白的糖基化改變也有關(guān)。另外粘液細(xì)胞癌還能分泌釋放大量蛋白水解酶， 破壞癌細(xì)胞鈣橋，溶解癌巢周圍軟組織。因此胃粘液細(xì)胞癌侵襲力強，轉(zhuǎn)移率高。
[0009] 目前，基于CEA的影像學(xué)診斷尚未報道和應(yīng)用。因此，獲得能檢測CEA蛋白的抗體 對于多種腫瘤的檢測、影像學(xué)診斷和治療顯得非常有意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了一種抗人癌胚抗原抗體，該抗體為全人源抗人癌胚抗原抗體，與人 癌胚抗原具有高親和力，能用于檢測和治療人體癌癥疾病。
[0011] 一種抗人癌胚抗原抗體（簡稱抗人CEA蛋白抗體），包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變 區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的三個高變區(qū)⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3的氨基酸序列分別為:GFAVSSN、 HRSGN、VPGFSRGQYEESWYFDL其輕鏈可奪厭的三個高奪厭CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列 分別為RASQSIDSYLN、GASNLRN、HQAYSPFT。
[0012] 其中，重鏈可變區(qū)的三個高變區(qū)⑶RH1、⑶RH2、⑶RH3分別位于重鏈可變區(qū)的第 26~32位、第52~56位和第98~114位；輕鏈可變區(qū)的三個高變區(qū)⑶RL1XDRL2、⑶RL3 分別位于輕鏈可變區(qū)的第24~34位、第50~56位和第89~96位。
[0013] 在抗體分子可變區(qū)上，三個高變區(qū)的氨基酸序列存在很大的變異性，而高變區(qū)之 間的區(qū)域氨基酸序列則變化較小。這三個高變區(qū)在空間結(jié)構(gòu)上可與抗原決定簇形成精密的 互補，因此又被稱為互補決定區(qū)（CDR)，不同重鏈輕鏈的CDR決定了抗體對抗原的特異性。
[0014] 優(yōu)選地，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨 基酸序列如SEQ IDNo. 2所示。
[0015] 所述的抗人癌胚抗原抗體可以是全抗體或全抗體的抗原結(jié)合部分。所述的全抗體 優(yōu)選為IgGl型；所述的抗原結(jié)合部分優(yōu)選為Fab片段、Fab'片段、F(ab'） 2片段或單鏈抗 體，更優(yōu)選為單鏈抗體。
[0016] 抗原結(jié)合部分既保留了能與抗原特異結(jié)合的區(qū)域，又避免了 Fc片段的抗原性而 引起的副作用；其中單鏈抗體具有易滲透腫瘤組織中增加藥物濃度，免疫原性小，在體內(nèi)循 環(huán)的半衰期短、易于清除，易于與毒素或酶基因連接從而直接獲得免疫毒素或酶標(biāo)抗體等 優(yōu)點。
[0017] 抗原結(jié)合部分可以通過DNA重組技術(shù)或通過酶促/化學(xué)裂解全抗體來制備。本發(fā) 明【具體實施方式】中以抗人癌胚抗原（CEA)單鏈抗體為例，其制備方法為：采用公開號為CN 1444651 A的中國專利文獻公開的方法構(gòu)建人單鏈抗體文庫，并在該人單鏈抗體文庫中篩 選抗人CEA蛋白抗體。
[0018] 本發(fā)明還提供了所述的抗人癌胚抗原抗體的編碼基因，具體地，重鏈可變區(qū)編碼 基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，輕鏈可變區(qū)編碼基因如SEQ ID No. 4所示。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種包含所述的編碼基因的重組載體或表達(dá)系統(tǒng)。所述重組載體 的原始載體為PACT2或pET27b。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述的抗人癌胚抗原抗體在制備腫瘤體外診斷試劑或腫瘤影像 診斷試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明抗人癌胚抗原抗體能夠特異性地結(jié)合人癌胚抗原，可用于腫瘤 病人血清樣本CEA腫瘤標(biāo)志物的檢測；也可將抗人癌胚抗原抗體注入人體內(nèi)通過影像診斷 對腫瘤進行影像檢測。
[0021] 其中，在上述兩種應(yīng)用中，所述人癌胚抗原是一種廣譜性的腫瘤標(biāo)志物，可用于多 種腫瘤疾病的檢測和預(yù)防，例如：大腸癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、膽管癌、乳腺癌、卵巢、 甲狀腺髓樣癌和泌尿系統(tǒng)的腫瘤等。
[0022] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0023] 本發(fā)明抗人癌胚抗原抗體是一種既能用于檢測多種腫瘤、也能治療和預(yù)防人體疾 病的全人源抗人癌胚抗原抗體，具有非常高的親和力，能夠特異性結(jié)合人癌胚抗原，有效檢 測多種腫瘤，對治療相關(guān)腫瘤具有重要作用。
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明抗人CEA蛋白單鏈抗體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0025] 圖2為本發(fā)明抗人CEA蛋白單鏈抗體#HCEA-A的特異性ELISA分析；
[0026] 圖3為本發(fā)明抗人CEA蛋白單鏈抗體#HCEA-A ELISA法檢測多種腫瘤病人血清的 結(jié)果；
[0027] 圖4為本發(fā)明抗人CEA蛋白單鏈抗體#HCEA-A檢測小鼠腫瘤模型的影像結(jié)果；
[0028] A為白光條件下腫瘤模型裸鼠的照片；
[0029] B為在暗室中用620nm激發(fā)光觀察人CEA的單鏈抗體hCEA-