A與ICG偶聯(lián)物在腫瘤 模型裸鼠的影像（白色部分為抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生的熒光）。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0031] 實施例1抗人CEA蛋白單鏈抗體的篩選
[0032] 本實施例構(gòu)建單鏈抗體庫，并針對此單鏈抗體庫進(jìn)行抗人CEA蛋白單鏈抗體的篩 選。
[0033] 采用公開號為CN 1444651 A的中國專利文獻(xiàn)公開的方法構(gòu)建人單鏈抗體文庫，并 在該人單鏈抗體文庫中篩選抗人CEA蛋白單鏈抗體，具體實施過程如下：
[0034] 1、擴增得到人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)DNA
[0035] 以來自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白細(xì)胞的poly A+RNA(購自Clontech) 為模板，利用oligo(dT)和隨機引物（random primers)，使用逆向轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（購自 Clontech)，根據(jù)Clontech試劑盒所提供的方法指南，將poly A+RNA逆向轉(zhuǎn)錄成cDNA〇
[0036] 以上述cDNA為模板，利用一系列識別人抗體重鏈可變區(qū)（VH)和輕鏈可變區(qū)（VL) 基因的引物，進(jìn)行PCR擴增得到人抗體中所有的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的DNA序列。一 系列識別人抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的引物序列如下：
[0037]第一組為擴增人抗體重鏈可變區(qū)（VH)基因的5'-端引物（SEQ ID No. 11~17)， 包括：
[0038] VHlb : 5 ' -CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3 ' ；
[0039] VH2b ：5, -CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3' ；
[0040] VH3b ：5, -CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G-3' ；
[0041] VH4b : 5 ' -CCATACGATGTTCCAGATTACGAGGTGCAGCTG (G/T)TGGAG (A/T)C (C/T)-3 ' ；
[0042] VH5b : 5 ' -CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGTCTGG-3 ' ；
[0043] VH6b : 5，-CCATACGATGTTCCAGATTACCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3，；
[0044] VH7b ：5, -CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)TCTGG-3' ；
[0045] 第二組為擴增人抗體重鏈可變區(qū)（VH)基因的3'-端引物（SEQ ID No. 18~23)， 包括：
[0046] VHlf ：5, -GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3' ；
[0047] VH2f ：5, -GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3' ；
[0048] VH3f ：5, -GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3' ；
[0049] VH4f ：5, -GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3' ；
[0050] VH5f ：5, -GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3' ；
[0051] VH6f ：5, -GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3' ；
[0052] 第三組為擴增人抗體A-輕鏈可變區(qū)（V A)基因的5'-端引物（SEQIDNo. 24~ 32)，包括：
[0053] VLlb :5, -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3，；
[0054] VL2b : 5 ' -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3 ' ；
[0055] VL3b ：5, -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T) (A/G)CAGC(C/T)ACC-3' ；
[0056] VL4b ：5, -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G) (C/T)C_3,；
[0057] VL5b : 5 ' -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3 ' ；
[0058] VL6b : 5 ' -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3 ' ；
[0059] VL7b : 5，-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3，；
[0060] VL8b : 5 ' -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG (C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3 ' ；
[0061] VL9b ：5, -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3' ；
[0062] 第四組為擴增人抗體A-輕鏈可變區(qū)（VA)基因的3' -端引物（SEQ IDNo.33~ 34)，包括：
[0063] VLlf ：5, -GGGGTTTTTCAGTATCTACGATAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3'；
[0064] VL2f ：5, -GGGGTTTTTCAGTATCTACGAGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3' ；
[0065] 第五組為擴增人抗體k-輕鏈可變區(qū)（Vk)基因的5' -端引物（SEQ ID No. 35~ 38)，包括：
[0066] VKlb :5' -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3' ；
[0067] VK2b : 5 ' GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3 ' ；
[0068] VK3b : 5 ' -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T) CTCC-3' ；
[0069] VK4b ：5, -GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3' ；
[0070] 第六組為擴增人抗體k-輕鏈可變區(qū)（Vk)基因的3' -端引物（SEQ ID No. 39~ 42)，包括：
[0071] VKlf ：5, -GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATTTCCACCTTGGTCC-3' ；
[0072] VK2f ：5, -GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATCTCCA(C/G)CTTGGTCC-3 ?；
[0073] VK3f ：5, -GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATATCCACTTTGGTCC-3' ；
[0074] VK4f ：5, -GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3'。
[0075] 擴增人抗體中的重鏈可變區(qū)（VH)時，利用第一組引物與第二組引物的組合，即有 42個PCR反應(yīng)；擴增人抗體中的X-輕鏈可變區(qū)（VX)時，利用第三組引物與第四組引物 的組合，即有18個PCR反應(yīng)；擴增人抗體中的k輕鏈可變區(qū)（Vk)時，利用第五組引物與第 六組引物的組合，即有16個PCR反應(yīng)。
[0076] 第一組引物中包含有酵母雙雜交載體pACT2(Hua SB，Luo Y，Qiu M，Chan E， Zhou H，Zhu L. (1998)Gene. 215 :143-152.)(Hua SB，Qiu M，Chan E，Zhu L，Luo Y. (1997) Plasmid. 38:91-96.)多克隆位點的上游同源序列（下劃線部分）；第四組和第六組引物中 包含有酵母雙雜交載體PACT2多克隆位點的下游同源序列（下劃線部分）；而第二組、第三 組和第五組引物中包含有連接肽序列（下劃線部分），連接肽用于連接抗體的重鏈可變區(qū) 和輕鏈可變區(qū)。
[0077] 擴增時，PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件均相同，PCR反應(yīng)體系為：
[0078]
【主權(quán)項】
1. 一種抗人癌胚抗原抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其特征在于，所述重 鏈可變區(qū)的三個高變區(qū)CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分別為:GFAVSSN、HRSGN、 VPGFSRGQYEESWYFDL:其輕鏈可奪厭的三個高奪厭CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分別 為RASQSIDSYLN、GASNLRN、HQAYSPFT〇
2. 如權(quán)利要求1所述的抗人癌胚抗原抗體，其特征在于，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序 列如SEQ ID No. 1所示，所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
3. 如權(quán)利要求2所述的抗人癌胚抗原抗體，其特征在于，所述抗人癌胚抗原抗體為全 抗體或全抗體的抗原結(jié)合部分。
4. 如權(quán)利要求3所述的抗人癌胚抗原抗體，其特征在于，所述的全抗體為IgGl型。
5. 如權(quán)利要求3所述的抗人癌胚抗原抗體，其特征在于，所述的抗原結(jié)合部分為Fab片 段、Fab'片段、F(ab'）2片段或單鏈抗體。
6. -種如權(quán)利要求2所述的抗人癌胚抗原抗體的編碼基因，其特征在于，重鏈可變區(qū) 編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，輕鏈可變區(qū)編碼基因如SEQ ID No. 4所示。
7. -種包含權(quán)利要求6所述的編碼基因的重組載體。
8. -種包含權(quán)利要求6所述的編碼基因的表達(dá)系統(tǒng)。
9. 如權(quán)利要求1~5任一項所述的抗人癌胚抗原抗體在制備腫瘤體外診斷試劑中的應(yīng) 用。
10. 如權(quán)利要求1~5任一項所述的抗人癌胚抗原抗體在制備腫瘤影像診斷試劑中的 應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗人癌胚抗原抗體及其編碼基因和應(yīng)用，該抗人癌胚抗原抗體包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的三個高變區(qū)CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分別為：GFAVSSN、HRSGN、VPGFSRGQYEESWYFDL；其輕鏈可變區(qū)的三個高變區(qū)CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分別為RASQSIDSYLN、GASNLRN、HQAYSPFT。該抗體為全人源抗人癌胚抗原抗體，與人癌胚抗原具有高親和力，能用于檢測和治療人體癌癥疾病。
【IPC分類】G01N33-574, C07K16-30, A61K49-00, C12N15-13, C12N15-63
【公開號】CN104628859
【申請?zhí)枴緾N201510039112
【發(fā)明人】王煒, 侯偉, 王麗江, 余乃絢
【申請人】佳德資本投資管理（Bvi）有限公司, 褚欽梁
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月26日