[0029] 實施例1 ;解淀粉芽抱桿菌化263菌株的篩選
[0030] (1)水稻材料；所采用的樣品為水稻葉片，品種為迂星1號，采集地點為迂寧省東 港市。
[0031] (2)所用的培養(yǎng)基：
[00對 1)牛肉膏培養(yǎng)基（NA);牛肉膏3g，大豆蛋白腺7g，化C1 5g，瓊脂20g，lL化0,抑 值為7. 2。
[003引 2)牛肉膏液體培養(yǎng)基（NB):牛肉膏3g，大豆蛋白腺7g，化C1 5g，1L地20,抑值為 7. 2。
[0034] 扣膜蛋白腺液體培養(yǎng)基（LB);膜蛋白腺lOg，酵母粉5g，化C1 10g，lL化0,抑值 為 7. 2。
[0035] 4)番茄燕麥培養(yǎng)基；燕麥40g，番茄汁150血，瓊脂20g，CaC〇3〇. 6g，1L地2〇。
[0036] (3)芽抱桿菌的分離；(a)水稻葉片經(jīng)清水沖洗干凈，1 %次氯酸鋼消毒8min，無菌 水漂洗4次，取100 y 1第4次漂洗水涂牛肉膏培養(yǎng)基平板培養(yǎng)3d，無菌落出現(xiàn)，表明水稻 葉片表面滅菌干凈；化）將表面滅菌水稻組織分段，約2g放入已滅菌研鉢中，加適量滅菌石 英砂、lOmL無菌水進行充分研磨，取所獲汁液ImU加入含9mL無菌水的試管中，震蕩混合均 勻。梯度稀釋至1(T 3濃度，將10 4、l(T2、l(r3濃度的稀釋液在80°C的水溫中水浴30min，分 別取100 y 1涂牛肉膏培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)。（C)對獲得的菌落根據(jù)菌落形態(tài)進行單菌落 純化培養(yǎng)；挑取純化的菌株單菌落，置于15%的甘油中，-8(TC超低溫保存。
[0037] (4)防治稻癌病芽抱桿菌的篩選：
[003引1)芽抱桿菌菌株發(fā)酵液的制備：將菌株從-80°C冰箱中取出，接種在牛肉膏培養(yǎng) 基平板上培養(yǎng)活化2化，接入100血巧00血的S角瓶）的牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)液中，28 °C， 18化/min,培養(yǎng)2化，得菌株種子液。取所得種子液，按2%的接種量加入到100血巧00血的 S角瓶）的牛肉膏蛋白腺培養(yǎng)液中，28°C，180r/min，培養(yǎng)2d，得菌株發(fā)酵液。
[0039] 2)芽抱桿菌離體葉片防效測定；取水稻四葉期功能葉，置超聲波清洗儀清 洗5min，無菌水沖洗3次，置超凈工作臺驚干，剪為8cm長片段，化263發(fā)酵液浸泡 (1. 0X 108c化?血-1)處理0.化，置超凈工作臺驚干。在培養(yǎng)皿里墊滅菌濕潤濾紙保濕，平 行放入滅菌竹制牙簽，將葉片放在培養(yǎng)皿中的牙簽上，使葉片與濾紙不發(fā)生接觸，每皿4個 葉片，葉片兩端用濕潤脫脂棉纏繞保濕，2化后將稻癌菌抱子懸浮液（IX 105c化-mL-1)懸 滴于葉片上，每葉片4滴，每滴20 y L 28°C暗處理2化后轉(zhuǎn)入1化光照；她黑暗光周期，設(shè) 僅用無菌水處理為對照1，僅接稻癌菌的處理為對照2, 5d后觀察，統(tǒng)計發(fā)病結(jié)果，計算病斑 抑制率：
[0040] 病斑抑制率=刷胥葉片病斑數(shù)-髓葉片病斑數(shù)X!00〇/〇? 對照葉片病斑數(shù)
[0041] 經(jīng)離體葉片防效檢測，篩選得到防效最高的菌株化263的病斑抑制率為66. 56%， 并且葉片病斑擴展速度明顯比只接稻癌菌的對照慢。表明化263菌株在水稻離體條件下對 葉癌有明顯的抑制病菌侵染形成病斑，并延緩病害發(fā)展、抑制病斑擴展的效果。
[0042] (5)解淀粉芽抱桿菌的鑒定；經(jīng)綜合16S rDNA及gyrA測序和序列比對鑒定，結(jié) 果表明：化263的16S rDNA基因序列與解淀粉芽抱桿菌同源性為99%，并與解淀粉芽抱 桿菌佑U688203)、解淀粉芽抱桿菌（FJ844828)、枯草芽抱桿菌佑U888127)、枯草芽抱桿菌 (冊327128)聚為一大類（參見圖1)。解淀粉芽抱桿菌為枯草芽抱桿菌的近緣種，由于它們 有非常相似的顯微特征和理化特征，采用常規(guī)的鑒定方法很難準(zhǔn)確區(qū)分，而利用gyrA基因 可W有效區(qū)分，結(jié)果表明，解淀粉芽抱桿菌與枯草芽抱桿菌分別聚為兩大類（參見圖2)。通 過16S rDNA及gyrA系統(tǒng)進化樹分析，菌株化263為解淀粉芽抱桿菌。
[0043] 發(fā)明人已將本菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏日期為2014年5月21日，保藏編號為CGMCC No. 9191。
[0044] 實施例2 ;解淀粉芽抱桿菌化263菌株的生物活性測定；
[0045] (1)解淀粉芽抱桿菌化263對稻葉癌溫室盆栽防效試驗：分別W麗江新團黑谷、迂 星1號水稻品種為實驗材料，在水稻四葉一屯、期，葉片噴施1%硫酸錠溶液，3d后，選取生長 一致的植株進行生防試驗。制備1 X 105c化'mL-1的稻癌菌抱子懸浮液，對化263菌株進行 噴霧接種，接種后保持黑暗12h，濕度90%?；?，W化263菌株發(fā)酵液對接種過病原菌的 水稻植株進行噴霧，濃度為1. 0X 108c化?血-1，每處理30株，W清水噴霧的處理為對照1， 僅接種稻癌病菌的處理為對照2。1周后調(diào)查葉癌發(fā)病請況，計算病情指數(shù)及防效（參見表 1)。
[0046] 表1菌株化263對稻葉癌的溫室盆栽防效試驗
[0047]
【主權(quán)項】
1. 一種防治稻瘟病的解淀粉芽孢桿菌RL263 (Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日期為2014年5月21日， 保藏編號為CGMCC No. 9191。
2. -種菌劑，其包含如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌RL263。
3. -種防治稻瘟病的方法，其包括將如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌RL263或如 權(quán)利要求2所述的菌劑施用于水稻作物。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述菌劑為所述解淀粉芽孢桿菌RL263的培 養(yǎng)液。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病為苗稻瘟、葉瘟、葉枕瘟、節(jié) 稻瘟、穗頸瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述稻瘟病為葉瘟和/或穗頸瘟。
7. 如權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌RL263或如權(quán)利要求2所述的菌劑在防治稻瘟 病中的用途。
8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病為苗稻瘟、葉瘟、葉枕瘟、節(jié)稻 瘟、穗頸瘟、穗瘟、枝梗瘟和/或谷粒瘟。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述稻瘟病為葉瘟和/或穗頸瘟。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種防治稻瘟病的解淀粉芽孢桿菌RL263(Bacillus amyloliquefaciens)，包含所述解淀粉芽孢桿菌RL263的菌劑，使用所述解淀粉芽孢桿菌RL263防治稻瘟病的方法及其在防治稻瘟病中的用途。本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌具有對稻瘟病更高效的防治作用。CGMCC No.919120140521
【IPC分類】C12N1-20, A01P3-00, A01G7-06, C12R1-07, A01N63-00
【公開號】CN104630086
【申請?zhí)枴緾N201410671030
【發(fā)明人】王 琦, 李雙東, 李燕
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2014年11月20日