原肝干細(xì)胞和近肝干細(xì)胞的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是申請日為2003年3月14日、申請?zhí)枮?3809989. 6、發(fā)明名稱為"原肝干 細(xì)胞和近肝干細(xì)胞"的申請的分案申請。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及人類肝干細(xì)胞，產(chǎn)生成熟肝臟細(xì)胞的多能細(xì)胞。該些細(xì)胞包括兩個干 細(xì)胞群：真正的原祖細(xì)胞，即生成近肝干細(xì)胞的管板干細(xì)胞，W及生成肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞的 近干細(xì)胞。本發(fā)明也涉及分離人類肝管板干細(xì)胞W及分離近肝干細(xì)胞和定向肝細(xì)胞祖細(xì)胞 和定向膽管祖細(xì)胞的方法；包括本發(fā)明的細(xì)胞的組合物可用于細(xì)胞和基因治療W及用于建 立生物人工器官。
【背景技術(shù)】
[000引 1.人類肝的解剖學(xué)
[0004] 成熟肝的基本結(jié)構(gòu)和功能單位是腺泡，其在橫截面上的組織形式象圍繞兩個獨特 血管床的輪子；周邊是3-7組肝口H聯(lián)體（protal triad)(每組各具有口靜脈、肝動脈和膽 管），而中也是中央靜脈。肝細(xì)胞組織為細(xì)胞板結(jié)構(gòu)，兩側(cè)均她鄰有孔內(nèi)皮，形成一系列與肝 口和中央脈管系統(tǒng)相鄰近的竇狀隙。最近的數(shù)據(jù)表明赫令氏管（Canals of化ring),即一 種位于肝口H聯(lián)體周圍的小管，在I帶各處產(chǎn)生細(xì)小的小管，它們延伸并切入肝板，形成類 似于瓶刷的模式（Theise，N. 1999 化patology. 30:1425-1433)。
[0005] 稱之為狄氏隙（space of Disse)的狹窄空間沿著竇狀隙將內(nèi)皮與肝細(xì)胞分隔開 來。作為該種組織結(jié)構(gòu)的結(jié)果是，肝細(xì)胞具有兩個基部結(jié)構(gòu)域（各自面對一個竇狀隙）和 一個頂部結(jié)構(gòu)域（由她鄰肝細(xì)胞的接觸區(qū)形成）。該基部結(jié)構(gòu)域和血液接觸并參與血漿成 分的吸收和分泌，而頂部結(jié)構(gòu)域則形成膽汁小管，專營膽汁鹽的分泌，并且通過交聯(lián)的網(wǎng)絡(luò) 與膽管相聯(lián)。血管從口靜脈和肝動脈流過竇狀隙到達(dá)終末肝靜脈和中央靜脈。
[0006] 根據(jù)該種微循環(huán)模式，將腺泡分成H個帶；1帶，n周區(qū)；2帶，腺泡中區(qū)；W及3 帶，中也周圍區(qū)。增殖潛能、形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)、（染色體）倍性W及多數(shù)肝臟特異性基因與帶狀 分布相互關(guān)聯(lián)（Gebhar化，R 等，1988.陽BS Lett. 241:89-93 ;Gumucio，J.J. 1989, Vol. 19. Springer International, Madrid ；Traber, P.等，1988. Gastroenterology. 95:1130-43)。 跨腺泡并且是沿著從肝口H聯(lián)體到中央靜脈血流方向上的血液成分（包括氧氣）濃度的梯 度，負(fù)責(zé)該種成帶現(xiàn)象中一部分，例如糖酵解和糖異生的互逆區(qū)室化。然而，間隙銜接蛋白 連接蛋白26的口周區(qū)成帶現(xiàn)象W及谷氨醜胺合成酶的中也周圍區(qū)成帶現(xiàn)象等（此處僅舉 兩例），對此類梯度是不敏感的，而代表了多數(shù)組織特異性基因，并且似乎是由微環(huán)境中對 細(xì)胞或者除血流W外的變量而言所固有的因子決定的。
[0007] 除了肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞（膽管細(xì)胞）和內(nèi)皮細(xì)胞外，肝口和中央膽管之間的區(qū) 域還含有其它細(xì)胞類型，例如膽脂細(xì)胞（Ito cell)和枯否細(xì)胞（Kupffer cell)。該些細(xì)胞 在肝臟病理狀況下起著突出的作用，尤其是在炎癥和纖維癥中，但它們對正常器官主要穩(wěn) 態(tài)功能的直接貢獻(xiàn)明顯要小。
[000引 2.人類肝的發(fā)育
[0009] 肝臟是由尾前腸和橫隔（內(nèi)臟間充質(zhì)的一部分）形成的憩室匯聚發(fā)育的結(jié)果。肝 細(xì)胞的形成很可能是通過成纖維細(xì)胞生長因子，起始于內(nèi)胚層上皮細(xì)胞與生也中胚層相互 作用之后。特化的肝細(xì)胞隨之增殖并W索狀方式穿入橫隔的間充質(zhì)，形成肝臟原基。上 皮-間充質(zhì)的直接相互作用在肝臟的該些早期發(fā)育階段中是關(guān)鍵性的，并規(guī)定哪些細(xì)胞將 分別成為肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞W及有孔內(nèi)皮細(xì)胞。間充質(zhì)特異性基因hlx和jumonji的突變 將阻斷肝臟發(fā)育，從而闡釋了該組織貢獻(xiàn)的重要性。在其發(fā)育早期，肝臟由成簇的近肝干細(xì) 胞組成，其由缺乏基膜的連續(xù)內(nèi)皮細(xì)胞和豐富的造血細(xì)胞包圍。在內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為非連 續(xù)的有孔內(nèi)皮細(xì)胞時，維管結(jié)構(gòu)尤其是肝口維管結(jié)構(gòu)隨著基膜的產(chǎn)生發(fā)育程度更高。肝口 條間部可能為膽管發(fā)育提供引發(fā)機(jī)制，并且由于它環(huán)繞口靜脈、肝動脈和膽管，而形成了肝 口H聯(lián)體。很可能是為了應(yīng)答諸如C-CAM 105、A甜110、E-巧粘連蛋白和連接蛋白的組織形 成分子在數(shù)量和分布上的變化，近肝干細(xì)胞迅速增殖并且形成實質(zhì)肝板，同時伴有多數(shù)但 并非所有造血細(xì)胞再定位于骨髓之中。最近的研究提示某些造血祖細(xì)胞存留于成年靜息的 曬齒類動物的肝臟中，并且已從成年人類和鼠的肝臟中都分離到造血干細(xì)胞（化〇sbie，0. M.等 1999.化patology. 29:1193-8)。
[0010] 大鼠肝臟在胚胎周期的大約第10天形成，稱之為"胚胎第10天"或E10， 其中位于胚胎中腸區(qū)的內(nèi)胚層的也臟間充質(zhì)內(nèi)陷狂aret, K. 1998.化rrent化inion in Genetics&Development. 8:526-31)。胚胎中肝臟細(xì)胞的最早識別是利用編 碼a -胎蛋白（AFP)的mRNA的原位雜交研究實現(xiàn)的狂ARET，K. 1998. Current Opinion in Genetics&Development. 8:526-31 ；Zaret,K. 1999Developmental Biology的rlando). 209:1-10)。在第9-10天，在所有測定的大鼠和小鼠肝臟中接近于產(chǎn)生 也臟的間充質(zhì)的胚胎中腸區(qū)觀察到AFP表達(dá)細(xì)胞。到E12時，肝臟肉眼可見，并且到E13時 直徑大約為1mm。
[0011] 與之并行的是，隨著第一個可識別的造血細(xì)胞在E15-E16(曬齒類動物）W及第3 到第4個月（人類）的出現(xiàn)而產(chǎn)生造血作用，并且紅細(xì)胞生成（紅細(xì)胞樣細(xì)胞或紅細(xì)胞的 形成）的高峰發(fā)生在E18(曬齒類動物）W及第5到第6個月（人類）。在紅細(xì)胞生成高峰 時，紅細(xì)胞的數(shù)目在肝臟中占優(yōu)勢地位，并且占肝臟中多于70%的細(xì)胞數(shù)目。妊娠期結(jié)束 時在曬齒類動物中是第21天，而在人類中是第9個月。在分娩的幾個鐘頭內(nèi)，造血細(xì)胞的 數(shù)目急劇下降，W至于到出生后周期的第2天（曬齒類動物）W及一周或兩周內(nèi)（人類）， 絕大多數(shù)造血細(xì)胞消失遷往骨髓。無人知曉造血細(xì)胞遷移的原因。不過存在兩種主要的猜 測。
[0012] 第一種，造血祖細(xì)胞偏好相對厭氧的條件，并且隨著肝臟中氧氣水平因肺活動的 升高，它們中的多數(shù)遷往骨髓（該里相對是厭氧的）。另外，存在孕激素的喪失也可能是遷 移因素的猜測。出生后，肝臟中造血祖細(xì)胞的喪失與肝祖細(xì)胞數(shù)目的顯著下降W及成熟肝 細(xì)胞和膽管細(xì)胞數(shù)目的并行上升有關(guān)。肝臟的完全成熟在出生后周期的2-3周（曬齒類 動物）W及數(shù)月內(nèi)（人類）完成。此時殘余的肝祖細(xì)胞分布在赫令氏管區(qū)，而主要數(shù)目的 肝祖細(xì)胞存在于各肝腺泡外周的肝口H聯(lián)體中訂hiese等，化aw化rd等）。
[0013] 此后，肝腺泡的典型構(gòu)造得W確立，其中各肝腺泡外周由6組肝口H聯(lián)體保衛(wèi)，每 組具有膽管、肝動脈和肝經(jīng)脈，并且中也是與腔靜脈相連接的中央靜脈。肝臟細(xì)胞板象輪子 的福條一樣，自中也向外周延伸。按照慣例，將所述板分為H個區(qū)；1區(qū)靠近肝口H聯(lián)體；2 區(qū)在腺泡中；而3區(qū)靠近中央靜脈。肝臟中僅有的雙倍體細(xì)胞位于1區(qū)中；四倍體細(xì)胞位于 2區(qū)；而四倍體、八倍體及多核細(xì)胞位于3區(qū)。該模式高度暗示了一種終止于細(xì)胞調(diào)亡程序 的成熟譜系（Sigal, S.比，S.等 1995. Differentiation. 59:35-42)。
[0014] 3.肝臟疾病
[0015] 在美國，每年有大約250, 000人因肝臟衰竭而住院。肝臟移植能夠有效地治療某 些類型的肝臟衰竭，每年在美國進(jìn)行大約4, 100例移植。肝臟移植的限制因素之一是供體 肝臟的可獲得性，特別考慮到用于器官移植的供體肝臟必須是源自經(jīng)歷腦死亡而非也臟停 滯的患者的限制。來自尸體供體的肝臟未曾成功過，盡管最近使用此類供體的努力已經(jīng)支 持了如果在死亡1小時之內(nèi)獲得肝臟，則可W使用它們的可能性。
[0016] 對多數(shù)肝臟疾病而言，將細(xì)胞移植到肝臟中是有吸引力的替代性療法。用于細(xì)胞 移植的手術(shù)操作相對于全器官移植所需的手術(shù)操作是微不足道的，因而可用于具有多種 手術(shù)風(fēng)險的患者，例如老年或體弱者。使用人類肝臟細(xì)胞優(yōu)于源自其它哺乳動物的肝臟細(xì) 胞，因為潛在的病原（如果有的話）是人源的，可被患者更好地耐受，且在用前可容易地加 W篩選。
[0017] 進(jìn)行肝臟細(xì)胞移植的嘗試中使用過未分級的成熟肝臟細(xì)胞，并已顯示出某些程度 的功效（Fox, 1. J.等，1998. New Elngland Journal of Medicine. 338:1422-1426)。然而，由 于該些細(xì)胞在體內(nèi)不生長，所W需要注射大量的細(xì)胞（2X1(T)才能成功。而且，引入大量 成熟的大肝臟細(xì)胞（平均細(xì)胞直徑30-50 ym)由于在注射時傾向于形成巨大的聚集體而復(fù) 雜化，導(dǎo)致潛在的致死性的栓子。另外，該些西北引起顯著的免疫注射反應(yīng)，從而使患者需 要免疫抑制性藥物才能維持其剩余的肝臟。最后，成熟的肝臟細(xì)胞還不能成功地低溫保藏， 因而需要復(fù)雜的后勤來協(xié)調(diào)合適的肝臟組織的可獲得性、細(xì)胞息液的制備W及用于臨床治 療的細(xì)胞的即刻遞送。
[001引 4.全能干細(xì)胞
[0019] 干細(xì)胞是基于細(xì)胞的肝臟疾病的替代性療法。全能干細(xì)胞是能夠自我復(fù)制、多能， 即能產(chǎn)生多種命運的子代細(xì)胞的原始細(xì)胞，其能夠廣泛地發(fā)育，產(chǎn)生能重建組織（一種或 多種）的定向干細(xì)胞。多數(shù)關(guān)于干細(xì)胞的文獻(xiàn)來自于有關(guān)胚胎的文獻(xiàn)或者有關(guān)造血、表皮 或腸組織的文獻(xiàn)。
[0020] 最近，該定義得到了修正，W區(qū)別特定類型的干細(xì)胞。具有參與所有細(xì)胞類型，女口 生殖細(xì)胞的發(fā)育的潛能的那些干細(xì)胞被稱之為全能干細(xì)胞，包括受精卵和達(dá)8細(xì)胞階段 (桑植胚）的正常胚胎細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞也稱為"ES"細(xì)胞，包括源于胚泡中全能的正常細(xì) 胞的永久細(xì)胞群，最初報道于20世紀(jì)80年代早期。ES細(xì)胞系可在體外培養(yǎng)并保持全能性。 當(dāng)將ES細(xì)胞注射回到正常的胚泡中時，它們能夠繼續(xù)胚胎發(fā)育，并參與形成正常但嵌合的 小鼠。盡管已用許多物種（小鼠、大鼠、豬等）建立了 ES細(xì)胞系，但只有小鼠系統(tǒng)，通過將 培養(yǎng)的修飾ES細(xì)胞與胚泡合并，然后將所述胚泡植入到假孕宿主中而被常規(guī)地用于產(chǎn)生 具有新表型（敲除、轉(zhuǎn)基因）的動物。胚胎生殖巧G)細(xì)胞系，其表現(xiàn)出ES細(xì)胞的多種特征， 可在體外直接地從原生殖細(xì)胞群中分離。與ES細(xì)胞一樣，當(dāng)注射到胚泡中時，EG細(xì)胞促