成 嵌合體包括生殖細(xì)胞系的形成。
[0021] 最近，大量公開的實(shí)驗(yàn)報(bào)道了人類ES細(xì)胞培養(yǎng)物可用人類胚胎建立。已有提示該 些人類ES細(xì)胞可注射到組織中，希望它們能夠重建受損的器官和組織。然而，如果將ES和 EG細(xì)胞引入到免疫受損宿主中除子宮W外的任何部位，都將導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，形成崎胎癌。所 W將人類ES細(xì)胞接種到患者中是不現(xiàn)實(shí)的，并具有在患者中造成腫瘤的嚴(yán)重可能性。為了 克服該種僵局，某些研究小組正尋求在限定的微環(huán)境條件下分化ES細(xì)胞，使之成為能夠安 全地接種到患者中的定向干細(xì)胞。例如，在產(chǎn)生造血祖細(xì)胞方面已有某些程度的成功。不 過，如果將培養(yǎng)物接種到患者中，仍然存在培養(yǎng)物中殘留的ES細(xì)胞可能構(gòu)成腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn) 的顧慮?？傊诎l(fā)育生物學(xué)將胚胎發(fā)生期間決定細(xì)胞命運(yùn)的種種控制掲示出來W前，ES細(xì) 胞仍將作為用于細(xì)胞或基因治療的臨床項(xiàng)目的幾乎沒有希望的實(shí)驗(yàn)工具。細(xì)胞和基因治 療的臨床項(xiàng)目的唯一現(xiàn)實(shí)的選擇是使用遺傳潛能限于有限數(shù)目的細(xì)胞類型的定向干細(xì)胞。 [00過 5.定向干細(xì)胞
[0023] 定向干細(xì)胞是將其遺傳潛能限于有限數(shù)目的細(xì)胞類型并具有廣泛的發(fā)育潛能的 多能細(xì)胞。越來越多的證據(jù)（例如來自端粒酶領(lǐng)域的證據(jù)）表明定向干細(xì)胞嚴(yán)格地說來并 不能自我復(fù)制，也就是說它們的子代比親代具有更小的發(fā)育潛能。定向干細(xì)胞產(chǎn)生定向祖 細(xì)胞，即通過將其遺傳潛能限于單一命運(yùn)而喪失多能性的子代細(xì)胞，例如其定向祖細(xì)胞被 稱為定向肝細(xì)胞祖細(xì)胞的肝細(xì)胞。在肝譜系中，存在定向肝細(xì)胞祖細(xì)胞（產(chǎn)生肝細(xì)胞）和 定向膽管祖細(xì)胞（產(chǎn)生膽管）。
[0024] 干細(xì)胞向成人細(xì)胞的轉(zhuǎn)變W階梯式的進(jìn)程進(jìn)行，產(chǎn)生成熟譜系，其中細(xì)胞大小、形 態(tài)、發(fā)育潛能和基因表達(dá)有賴于該譜系。衰老的比喻說法可用于定義該進(jìn)程。"年輕"細(xì)胞 具有早期基因表達(dá)和最大的發(fā)育潛能；譜系中的晚期細(xì)胞具有"晚期"基因表達(dá)，且通常發(fā) 育受限或根本不發(fā)育。所述晚期細(xì)胞可看作是"老年"細(xì)胞，或者生物學(xué)術(shù)語中的調(diào)亡細(xì)胞， 其最終被拋棄。成熟譜系進(jìn)程引起組織的自然周轉(zhuǎn)，并允許損傷后的再生。組織在成熟進(jìn) 程的動(dòng)力學(xué)方面有所差異。腸的成熟譜系相當(dāng)迅速，完整的一個(gè)循環(huán)在不到一周的時(shí)間內(nèi) 完成；而肝臟的成熟譜系緩慢發(fā)生，在大鼠肝臟中大約是1年。
[0025] 由于此類細(xì)胞群在肝臟疾病的治療中可能具有效果，所W對(duì)從肝臟中分離和鑒定 未成熟祖細(xì)胞有著強(qiáng)烈的臨床和商業(yè)興趣。在細(xì)胞和基因治療中使用肝祖細(xì)胞能夠克服 上述與使用成熟肝臟細(xì)胞相關(guān)的缺點(diǎn)。所述細(xì)胞不大（7-15 UM)，從而使得巨大栓子的形成 最小化。并且，所述細(xì)胞具有廣泛的發(fā)育潛能，該意味著重建患者的肝臟組織需要更少的細(xì) 胞。最后，祖細(xì)胞具有最小限度的可能引發(fā)免疫排斥的抗原標(biāo)志，提供了可能需要很少或者 無需免疫抑制藥物的希望。
[0026] 6.肝祖細(xì)胞的分離
[0027] 已知從肝臟中分離肝臟祖細(xì)胞是極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)，該是由于肝臟細(xì)胞缺乏陽性 選擇標(biāo)記。候選肝祖細(xì)胞唯一可用的抗體是針對(duì)肝祖細(xì)胞亞群（如果是從暴露于致癌劑侵 害后的宿主中分離的則被稱之為卵形細(xì)胞）制備的單克隆抗體。然而，該些抗體與存在于 造血細(xì)胞中的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。
[0028] 術(shù)語卵形細(xì)胞來自于致癌作用和腫瘤發(fā)生領(lǐng)域的無數(shù)研究。暴露于致癌物或 其它致癌劑侵害的動(dòng)物會(huì)發(fā)生成熟肝臟細(xì)胞的顯著喪失（被多種侵害殺死），并且繼發(fā) 地，具有卵形細(xì)胞核并攜帶有由肝細(xì)胞抗原及造血細(xì)胞抗原組成的標(biāo)記的小細(xì)胞（直徑 7-15 yM)發(fā)生擴(kuò)增（Grisham和化orgeirrson, 1998)。對(duì)卵形細(xì)胞的研究形成了該樣的 假說，即它們是肝祖細(xì)胞，在致癌劑侵害的條件下被激發(fā)擴(kuò)增，而且在合適的條件下可發(fā)展 為腫瘤細(xì)胞。卵形細(xì)胞的表型w細(xì)微或者非細(xì)微的方式變化，該取決于致癌劑侵害。而 且，已知它們?cè)谂囵B(yǎng)物中可容易地建立，無需特殊的飼養(yǎng)細(xì)胞或培養(yǎng)基條件（J. Grisham和 S.Thorgeirrson, 1998,Hepatic Stem Cells, In:Stem Cells, C Potten,editor. Academic Press, NY)。基于該些發(fā)現(xiàn)W及有關(guān)描述來自致癌劑處理的某些細(xì)胞系的特征的研究， 人們了解到肝臟腫瘤是惡性轉(zhuǎn)化的祖細(xì)胞，而且卵形細(xì)胞是部分或者完全轉(zhuǎn)化的祖細(xì) 胞(Zvibel I,Fiorino A, Brill S 和 Reid LM. Phenotypic characteriztaion of rat hepatoma cell lines and lineage-specific regulation of gene expression by differentiation agents. Differentiation 63:215-223,1999)。
[0029] 過去曾嘗試獲取肝祖細(xì)胞群，其被認(rèn)為是用于肝臟的細(xì)胞和基因治療的最為通用 的細(xì)胞群。美國專利No 5, 576, 207和5, 789, 246(Reid等）使用細(xì)胞表面標(biāo)志和側(cè)向散射 流式細(xì)胞儀提供了肝臟中限定的亞群。通過去除譜系的定向細(xì)胞，接著選擇未成熟肝祖細(xì) 胞已經(jīng)分離了大鼠肝臟細(xì)胞亞群，所述未成熟肝祖細(xì)胞是作為攜帶0C. 3-陽性（卵形細(xì)胞 抗原標(biāo)志）、AFP-陽性、白蛋白-陽性和CK19陰性（細(xì)胞角蛋白19)細(xì)胞標(biāo)志的非粒細(xì)胞 檢測(cè)的。前述大鼠肝臟亞群顯示了在從曬齒類肝臟中分離和鑒定富集的肝祖細(xì)胞中很重要 的特定特征。
[0030] 從而，存在著發(fā)展分離人類肝祖細(xì)胞的方法的需求，它可用于治療具有肝臟疾病 或機(jī)能障礙的患者。本發(fā)明滿足該種需求，而且也提供了治療方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0031] 本發(fā)明涉及包括人類原肝干細(xì)胞的組合物，所述原肝干細(xì)胞是近肝干細(xì)胞、肝細(xì) 胞祖細(xì)胞或膽管祖細(xì)胞的前體。本發(fā)明的人類原肝干細(xì)胞表達(dá)ep-CAM、AC133和白蛋白。
[0032] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是包括人類近肝干細(xì)胞的組合物，所述近肝干細(xì)胞是干 細(xì)胞或膽管祖細(xì)胞的前體。本發(fā)明的人類近肝干細(xì)胞表達(dá)a-胎蛋白、白蛋白和細(xì)胞角蛋 白19。
[0033] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是分離人類肝祖細(xì)胞的方法，包括鑒定表達(dá)ep-CAM和 AC133的細(xì)胞。由本方法分離到的人類肝祖細(xì)胞優(yōu)選表達(dá)白蛋白。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方 案中，分離的人類肝祖細(xì)胞是干細(xì)胞，優(yōu)選為原肝干細(xì)胞或近肝干細(xì)胞。
[0034] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是分離人類肝祖細(xì)胞的方法，包括在選擇人類原肝干細(xì) 胞的條件下，用無血清培養(yǎng)基表面培養(yǎng)來源于人類肝組織的細(xì)胞混合物，所述培養(yǎng)基包括 碳水化合物代謝調(diào)節(jié)劑、鐵載脂蛋白和膜產(chǎn)生因子，藉此形成含有人類原肝干細(xì)胞的集落。 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的人類原肝干細(xì)胞表達(dá)ep-CAM、AC133和白蛋白，并且優(yōu) 選還表達(dá)細(xì)胞角蛋白8/18和細(xì)胞角蛋白19。
[00巧]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是分離人類近肝干細(xì)胞的方法，包括在選擇人類肝干細(xì) 胞的條件下，用無血清培養(yǎng)基表面培養(yǎng)來源于人類肝組織的細(xì)胞混合物，所述培養(yǎng)基包括 碳水化合物代謝調(diào)節(jié)劑、鐵載脂蛋白和膜產(chǎn)生因子，藉此形成包括人類原肝干細(xì)胞的集落， 并用發(fā)育因子培養(yǎng)來自該集落的細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的人類近肝干細(xì) 胞表達(dá)a-胎蛋白、白蛋白和細(xì)胞因子19。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)育因子由第二細(xì) 胞提供，優(yōu)選為飼養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選是ST0飼養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞。
[0036] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是分離人類近肝干細(xì)胞的方法，包括在選擇人類肝干細(xì) 胞的條件下，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)來源于人類肝組織的細(xì)胞混合物，所述培養(yǎng)基包括碳水 化合物代謝調(diào)節(jié)劑、鐵載脂蛋白和膜產(chǎn)生因子，藉此形成包括人類原肝干細(xì)胞的集落，并用 發(fā)育因子培養(yǎng)來自該集落的細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，分離的人類近肝干細(xì)胞表 達(dá)a-胎蛋白、白蛋白和細(xì)胞因子19。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)育因子由第二細(xì)胞提 供，優(yōu)選為飼養(yǎng)細(xì)胞，優(yōu)選是STO飼養(yǎng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞。
[0037] 本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是分離的原肝干細(xì)胞。而本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案是分 離的人類近肝干細(xì)胞。
【附圖說明】
[0038] 圖1顯示了塑膠培養(yǎng)基上塑膠培養(yǎng)富集的胎兒實(shí)質(zhì)細(xì)胞第1天（上圖）和第5天 (下圖）形成的集落。
[0039] 圖2顯示了從第5天到第14天在塑膠培養(yǎng)基上形成的集落。
[0040] 圖3顯示了塑膠培養(yǎng)基上的集落形態(tài)。
[00川圖4顯示了塑膠上集落細(xì)胞白蛋白（第1排）、CK19 (第2排）、ep-CAM(第3排） 和NCAM (第4排）的染色。
[0042] 圖5塑膠上培養(yǎng)的集落的CD146和CD133 (頂部）W及AC133 (底部）的染色。
[0043] 圖6顯示了近干細(xì)胞在ST0飼養(yǎng)層原代培養(yǎng)7天后的白蛋白（第1排）、a-胎蛋 白（第2排）和CK19(第3排）染色。
[0044] 圖7顯示了從塑膠培養(yǎng)物中取出并涂布到ST0細(xì)胞飼養(yǎng)層上的集落細(xì)胞的發(fā)育。
[0045] 圖8-11顯示了在ST0飼養(yǎng)層上集落細(xì)胞的萌發(fā)。
[0046] 圖12和13顯示了人類肝臟細(xì)胞中AFP表達(dá)細(xì)胞的富集，其中圖12是原始細(xì)胞息 液中AFP和蛋白質(zhì)的表達(dá)；圖13是肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞制備物中的AFP表達(dá)。
[0047] 圖14-18顯示了共表達(dá)白蛋白、CD133和EP-CAM的成人肝臟細(xì)胞亞群的分離；其 中圖15A是白蛋白在CD-45排除人肝細(xì)胞中的表達(dá)；圖15B是白蛋白陽性人肝細(xì)胞的光散 射（正向和側(cè)向）；圖15C是白蛋白陰性人肝細(xì)胞的光散射（正向和側(cè)向）；圖16A是CD133 在成人肝細(xì)胞中的表達(dá)；圖16B是CD133陽性成人肝細(xì)胞通過磁性細(xì)胞分選的富集；圖17A 和B是具有陽性對(duì)照抗體（A)及EP-CAM抗體做的CD45排除人肝細(xì)胞的著色的FACS分 析；圖17C和D是具有CD133抗體的CD45排除人肝細(xì)胞似和共達(dá)CD133的EP-CAM的陽 性細(xì)胞做的著色的FACS分析；圖17E是CD133陽性和EP-CAM陽性細(xì)胞的雙重光散射分 析；圖18是具有陽性對(duì)照抗體（A)和EP-CAM抗體炬）的CD45排除人肝細(xì)胞的著色的FACS 分析。
[0048] 圖19描繪了在塑膠上培養(yǎng)的來自3個(gè)肝的9個(gè)干細(xì)胞在3周內(nèi)的生長(zhǎng)曲線。生 長(zhǎng)測(cè)量起始于培養(yǎng)12天后。曲線表明細(xì)胞生長(zhǎng)增倍時(shí)間為5. 2天。
[0049] 圖20描繪了新分離的胎兒肝臟細(xì)胞中及其隨后在塑膠基質(zhì)上培養(yǎng)期間的白蛋白 (ALB，上組）和a-胎蛋白（