青霉酸提高噬菌體產(chǎn)量的用途和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小分子化合物青霉酸能夠顯著提高瞻菌 體產(chǎn)量，W及采用青霉酸提高銅綠假單胞菌瞻菌體產(chǎn)量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界中，瞻菌體廣泛存在于各種環(huán)境中，其數(shù)量大約是細菌數(shù)量的10倍，給細 菌的生存帶來巨大選擇壓力。然而，宿主菌面對著巨大的被捕食壓力，更是進化出多種機制 抵御瞻菌體感染。銅綠假單胞菌是一種可W引起慢性感染的條件致病菌，是造成醫(yī)院內(nèi)感 染最普遍的條件致病菌之一，尤其是燒傷病人、肺炎患者等免疫力低下的人極易感染該種 病原菌。抗生素的大量使用使銅綠假單胞菌不斷出現(xiàn)耐藥菌，單純利用抗生素治療已經(jīng)不 能滿足需求，亟需新型殺菌劑，瞻菌體成為最好的候選殺菌因子。
[0003] 瞻菌體的生產(chǎn)是通過感染宿主菌進行的，獲得高濃度瞻菌體是瞻菌體應用的前 體。一般情況下，提高微生物產(chǎn)品的生產(chǎn)水平，途徑之一是增加微生物的生物量。然而，平 衡期高密度宿主菌細胞存在條件下，瞻菌體產(chǎn)量反而下降。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的在于提供一種提高銅綠假單胞菌瞻菌體產(chǎn)量的方法，為瞻菌體制劑在 工業(yè)中的應用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明通過加入小分子化合物青霉酸，顯著提高銅綠假單胞菌瞻 菌體的產(chǎn)量，對在工業(yè)中瞻菌體制劑的制備有著重要意義。
[0005] 本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
[0006] 青霉酸提高瞻菌體產(chǎn)量的用途。
[0007] 而且，所述瞻菌體為銅綠假單胞菌瞻菌體。
[0008] 青霉酸在制備工業(yè)中瞻菌體制劑中的用途。
[0009] 而且，所述瞻菌體為銅綠假單胞菌瞻菌體。
[0010] 一種青霉酸提高銅綠假單胞菌瞻菌體產(chǎn)量的方法，在銅綠假單胞菌培養(yǎng)基中加入 青霉酸。
[0011] 而且，所述青霉酸加入的終濃度為100 y M。
[0012] 而且，所述青霉酸提高瞻菌體感染過程中感染中也的數(shù)量。
[0013] 青霉酸在制備治療由銅綠假單胞菌引起的相關(guān)疾病的制劑中的應用。
[0014] 所述疾病包括肺炎、燒傷感染。
[0015] 一種銅綠假單胞菌抑菌劑，包括青霉酸。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：
[0017] 本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入小分子化合物青霉酸，使得銅綠假單胞菌活細胞增多，感 染中也數(shù)顯著增加，形成的瞻菌斑數(shù)量明顯增多，即小分子化合物青霉酸可W顯著提高銅 綠假單胞菌瞻菌體的產(chǎn)量，為瞻菌體應用打下基礎(chǔ)。
[0018] 本發(fā)明涉及的化合物為青霉酸（CAS number 90-65-3)，英文名稱為penicillic acid,分子式為CsHw〇4,分子量為170. 16,通過實驗發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中加入青霉酸，提高了細 菌細胞群體中活細胞的比例，增加了感染中也的數(shù)量，從而顯著提高了瞻菌體的滴度水平， 對在工業(yè)中瞻菌體制劑的制備有著重要意義。
【附圖說明】：
[0019] 圖1為瞻菌體K5在感染處于不同生長周期的宿主菌銅綠假單胞菌PAK-AR2后，形 成瞻菌斑能力的變化圖；
[0020] 圖2為宿主菌在平衡期形成的瞻菌體K5感染中也數(shù)與生長到對數(shù)期相比圖；
[0021] 圖3為宿主菌休眠細胞培養(yǎng)比例圖；
[0022] 圖4為在青霉酸作用下瞻菌體感染中也數(shù)隨著宿主菌生長周期圖；
[0023] 圖5為在青霉酸作用下瞻菌體感染變化圖；
[0024] 圖6為青霉酸顯著提高了瞻菌體形成瞻菌斑的能力圖。
【具體實施方式】
[00巧]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，W下實施例只是描述性的，不是限 定性的，不能W此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0026] 青霉酸提高瞻菌體產(chǎn)量的用途和方法，本發(fā)明為了證實青霉酸對瞻菌體的作用， 具體驗證即操作步驟如下：
[0027] 1、所用菌株為銅綠假單胞菌PAK-AR2 ;
[0028] 2、所用瞻菌體為瞻菌體K5 ;
[0029] 3、青霉酸的制備：利用色譜純無水己醇溶解固體青霉酸，配制成lOmg/mL，-2(TC 避光保存。準備用于所需實驗，使用終濃度為lOOuM;
[0030] 4、不同生長周期宿主菌形成瞻菌斑能力測定；W 30%接種量轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物銅 綠假單胞菌，分別加到有化合物青霉酸和不加青霉酸的LB培養(yǎng)基中，35C，leOrpm振蕩培 養(yǎng)。從化開始，每隔化取樣，作為指示菌與瞻菌體混合。將上述不同時間點的混合物與半 固體混合后，倒雙層平板，37 C，靜置培養(yǎng)化-6h，計數(shù)瞻菌斑數(shù)量。
[0031] 5、不同生長周期宿主菌形成瞻菌體感染中也能力測定；W 30%接種量轉(zhuǎn)接過夜 培養(yǎng)物銅綠假單胞菌，加到有化合物青霉酸的LB培養(yǎng)基中，35C，leOrpm振蕩培養(yǎng)。從0點 開始，每隔化取樣，作為瞻菌體K5宿主菌，從化開始不同生長周期宿主菌通過稀釋保持與 化大致相同的吸光度值，加入50 y L經(jīng)過稀釋大約為105P即/ml瞻菌體K5 (保證M0K0. 1)， 混勻。上述混合物靜置吸附lOmin，1300化pm離也Imin，棄上清。用新鮮LB洗上述得到的 沉淀物一次，13000巧m離也Imin，棄上清，將沉淀重息于10ml LB中，lOmin時取樣，與新鮮 指示菌混合，制雙層平板，37C靜置培養(yǎng)，4-化后計數(shù)出現(xiàn)的瞻菌斑數(shù)量，計算宿主菌不同 生長周期形成的瞻菌體感染中也數(shù)。
[0032] 6、活細胞數(shù)的測定；W 30%接種量轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物銅綠假單胞菌于加有化合 物青霉酸的LB培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)接前先將過夜培養(yǎng)物離也，去除上清中副產(chǎn)物的影響，35C， 16化pm振蕩培養(yǎng)。從化開始每隔化取樣，經(jīng)過稀釋，取適當稀釋度下的菌液100 y L，涂布 于LB固體培養(yǎng)基上，37C過夜培養(yǎng)，計數(shù)平板上出現(xiàn)的活菌數(shù)。
[0033] 7、流式細胞儀對不同生長周期宿主細胞亞群的測定：本發(fā)明選用試劑盒 LIVE/dead? BacLi曲t? Bacterial Vi油ility Kits對宿主不同生長周期的細胞進行染 色。W 30%接種量轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物銅綠假單胞菌，轉(zhuǎn)接前先將過夜培養(yǎng)物離也，去除上清中 副產(chǎn)物的影響，35°C，160巧m振蕩培養(yǎng)。分別在菌株生長到化、化和1化取樣,500化pm離 也5min，棄上清，利用0. 85 %生理鹽水洗菌體2-3次后，用0. 85