%生理鹽水重息。將上述 得到的不同生長周期的重息菌液進行稀釋至l〇6cell/mL，W 1:1的比例分別與SYT09和PI 混合，避光染色60min。將上述的染色液5000巧m離也5min，棄上清，利用0. 85 %生理鹽水 洗菌體3-4次，盡量去除游離的染色劑，然后用4%多聚甲酵固定染色細胞，過夜。將上述固 定過夜的細胞，再次利用0.85%生理鹽水洗菌體，并重息。設定流式細胞儀炬D公司）上樣 條件，將上述得到的樣品經(jīng)過流式細胞儀檢測。
[0034] 8、不同生長周期宿主菌對瞻菌體釋放量即裂解能力的影響；W銅綠假單胞菌為宿 主菌，分別取ImL不同生長周期銅綠假單胞菌與50 y L經(jīng)過稀釋大約為10中即/血瞻菌體 K5混合（保證M0K0. 1)，靜置吸附lOmin，1300化pm離也Imin，棄上清，去除沒有吸附的自 由瞻菌體顆粒數(shù)，利用新鮮LB重息宿主菌，洗一次，去除剩余的瞻菌體顆粒數(shù)，將宿主菌與 吸附瞻菌體混合物重息于10ml LB中。根據(jù)瞻菌體K5的一步生長曲線，分別在瞻菌體侵染 lOmin和60min取樣與敏感指示菌混合制雙層平板。37C培養(yǎng)，4-化后計數(shù)出現(xiàn)的瞻菌斑 數(shù)量。實驗重復H次。瞻菌體釋放量=60min瞻菌體顆粒數(shù)/lOmin瞻菌體顆粒數(shù)。
[0035] 9、小分子化合物青霉酸對瞻菌體滴度的影響測定；實驗分為兩組，分別轉接銅綠 假單胞菌過夜培養(yǎng)物，一組加入青霉酸終濃度為100 y M，一組作為對照組。從化開始每隔 化分別取4血不同生長周期宿主菌于無菌試管中，W大約1:1的比例加入瞻菌體K5, 37C， 22化pm振蕩培養(yǎng)化，W培養(yǎng)化的銅綠假單胞菌為指示菌，利用雙層平板法測定瞻菌體滴 度。
[003引結果分析：
[0037] 圖1顯示了瞻菌體K5在感染處于不同生長周期的宿主菌銅綠假單胞菌PAK-AR2 后，形成瞻菌斑能力的變化。在不同生長周期中均W相同數(shù)量的瞻菌體感染相同數(shù)量的宿 主菌，理論上產(chǎn)生的瞻菌斑數(shù)量應該相當，但是，結果顯示處于不同時期的宿主菌形成的 瞻菌斑數(shù)量差別較大。瞻菌斑數(shù)量在化到化之間上升，隨后，隨著宿主菌銅綠假單胞菌 PAK-AR2生長周期的延長，瞻菌斑的數(shù)量逐漸下降。宿主菌生長到化對數(shù)生長期出現(xiàn)的瞻 菌斑數(shù)量是宿主菌生長到1化平衡期出現(xiàn)瞻菌斑數(shù)量的73. 2倍。
[0038] 圖2顯示了宿主菌在平衡期形成的瞻菌體K5感染中也數(shù)與生長到對數(shù)期相比下 降了 93. 3倍。隨著宿主菌的生長細胞數(shù)逐漸增多，瞻菌體K5的吸附率幾乎不發(fā)生變化，說 明瞻菌體能感染宿主細胞。
[0039] 圖3顯示了宿主菌休眠細胞在宿主菌生長到2K化和1化時所占的比例分別為 27. 9%、84%和95. 1%，休眠細胞比例隨著宿主生長周期的延長逐漸升高。
[0040] 圖4顯示了在青霉酸作用下，瞻菌體感染中也數(shù)隨著宿主菌生長周期的延長下降 比例減小，宿主菌生長到化時，加入青霉酸后感染中也數(shù)提高6. 2倍，生長到1化時平衡期 感染中也數(shù)提高4. 3倍。
[0041] 圖5顯示了在青霉酸作用下，瞻菌體感染中也增加，活細胞數(shù)也相應增加，在平衡 期活細胞數(shù)提高了 11. 1倍。
[0042] 圖6顯示了青霉酸顯著提高了瞻菌體形成瞻菌斑的能力，當W生長到1化和14h 平衡期的宿主菌作為指示菌時，加入青霉酸瞻菌體形成的瞻菌斑數(shù)量分別比不加青霉酸提 高了 29. 8倍和33. 6倍。
[0043]菌株 PAK-AR2 來源于下列文獻：Wang J, Mushegian A, Loiy S, Jin S (1996) Large-scale isolation of candidate virulence genes of Pseudomonas aeruginosa by in vivo selection. Rroc Natl Acad Sci U S A 93 (19) : 10434-9。瞻菌體 K5 來源于下列文獻：Li L，Yang H，Lin S，Jia S口010)Classification of 17newly isolated virulent bacteriophages of Pseudomonas aeruginosa. Can J Microbiol 56(11):925-33doi:10. 1139/wl〇-〇75。
【主權項】
1. 青霉酸提高噬菌體產(chǎn)量的用途。
2. 根據(jù)權利要求1所述的青霉酸提高噬菌體產(chǎn)量的用途，其特征在于：所述噬菌體為 銅綠假單胞菌噬菌體。
3. 青霉酸在制備工業(yè)中噬菌體制劑中的用途。
4. 根據(jù)權利要求1所述的青霉酸在制備工業(yè)中噬菌體制劑中的用途，其特征在于：所 述噬菌體為銅綠假單胞菌噬菌體。
5. -種青霉酸提高銅綠假單胞菌噬菌體產(chǎn)量的方法，其特征在于：在銅綠假單胞菌培 養(yǎng)基中加入青霉酸。
6. 根據(jù)權利要求5所述的青霉酸提高銅綠假單胞菌噬菌體產(chǎn)量的方法，其特征在于： 所述青霉酸加入的終濃度為100 μ M。
7. 根據(jù)權利要求5所述的青霉酸提高銅綠假單胞菌噬菌體產(chǎn)量的方法，其特征在于： 所述青霉酸提高噬菌體感染過程中感染中心的數(shù)量。
8. 青霉酸在制備治療由銅綠假單胞菌引起的相關疾病的制劑中的應用。
9. 根據(jù)權利要求8所述的用途，其特征在于：所述疾病包括肺炎、燒傷感染。
10. -種銅綠假單胞菌抑菌劑，其特征在于：包括青霉酸。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種青霉酸提高噬菌體產(chǎn)量的用途和方法，通過實驗發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)基中加入青霉酸，提高了細菌細胞群體中活細胞的比例，增加了感染中心的數(shù)量，從而顯著提高了噬菌體的滴度水平，對在工業(yè)中噬菌體制劑的制備有著重要意義。本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入小分子化合物青霉酸，使得銅綠假單胞菌活細胞增多，感染中心數(shù)顯著增加，形成的噬菌斑數(shù)量明顯增多，即小分子化合物青霉酸可以顯著提高銅綠假單胞菌噬菌體的產(chǎn)量，為噬菌體應用打下基礎。
【IPC分類】A61P11-00, C12R1-92, C12N7-00, A61P17-02, A61K31-43, A61P31-04
【公開號】CN104630155
【申請?zhí)枴緾N201510045020
【發(fā)明人】楊洪江, 秦旭穎, 李夢菲
【申請人】天津科技大學
【公開日】2015年5月20日
【申請日】2015年1月29日