據峰面積確定該峰是否應該具有不止一個最大值（即不止一個峰）。采用這種調整是因 為使用RIN方法時發(fā)現(xiàn)的許多錯誤是由于28S峰和18S峰內有多個最大值（參見圖18)。 峰中多個峰或多個值的存在可用多種方式來確定。通過分析實驗數據，如果發(fā)現(xiàn)峰面積的 值比閾值小，那么允許該峰包含不止一個最大值。換言之，如果計算的面積與相應的峰不匹 配，即峰面積非常小而該峰實際上很大，那么該峰被定義為多峰型。例如，峰可以有兩個最 大值。在一個示例性實施方案中，閾值為〇. 2FU ?秒。此條件成功地修正了 RIN方法中大部 分先前未正確檢測到的實例。
[0200] 在308中，如果需要，根據這些峰相對于彼此的面積來調整偏移的18S區(qū)和28S 區(qū)的邊界。例如，如果偏移18S區(qū)中的18S峰面積除以總面積乘以100 (用18S%表示）小 于約8倍的偏移28S區(qū)中的28S峰面積除以總面積除以乘以100(用28S%表示），那么該 偏移的18S區(qū)被限定為42. 8-51. 4個單位的范圍（這里時間軸被轉換成一個0-100的量 級），即偏移的18S區(qū)的邊界從42. 8-50. 4個單位擴展至約42. 8-51. 4個單位。以類似的 方式，如果偏移28S區(qū)中的28S峰面積除以總面積乘以100(即28S% )小于約8倍的偏移 18S區(qū)中的18S峰面積除以總面積乘以100(即18S% )，那么該偏移的28S區(qū)被限定為約 52. 3-69. 5個單位的范圍（這里時間軸被轉換成一個0-100的量級），即偏移的28S區(qū)的邊 界從約58. 1-69. 5個單位擴展至約52. 3-69. 5個單位。
[0201] 在310中，如果需要，即如果基于峰的起始位置和終止位置以及實驗結果研究限 定的峰寬過大，那么要對峰寬進行調整。因此，在計算18S和28S峰寬之后，如果寬度在寬度 范圍之外，隨后則要調整峰寬，以使當時間軸被轉換成0-100量級時18S峰的峰寬應在0. 6 至7. 6個單位以內，28S的峰寬應在0. 8至10. 5個單位以內。
[0202] 在312中，如果對峰進行計算使得它們相距太遠，那么則要調整峰之間的距離以 加強18S峰和28S峰的限定。因此，如果18S峰和28S峰之間的距離大于距離閾值，通過選 擇不同的候選峰來調整18S峰和28S峰中的至少一個的位置。例如，在一些實施方案中，18S 峰的終止位置和28S峰的起始位置之間的距離限定為相隔小于約17. 1個單位。
[0203] 因此，本公開的另一方面是一種用于進行細胞RNA的RNA斷裂試驗（RDA)的方法， 其中該方法包括：獲得與一個時間點上的包含細胞RNA的特有生物樣品相對應的至少一個 電泳圖譜數據集；從所述至少一個電泳圖譜數據集中限定18S峰和28S峰；確定針對18S峰 和28S峰二者的至少一個參數值；以及，當需要時，根據應用于所述至少一個參數值的一個 或多個規(guī)則，重新限定18S峰和28S峰中的至少一個。在至少一些情況下，該方法還可進一 步包括確定18S峰面積和28S峰面積；和基于18S峰面積和28S峰面積中的至少一個來確 定RDA分數。
[0204] 在一些實施方案中，所述至少一個參數值包括峰面積、峰寬和峰位置中的至少一 個。
[0205] 所述一個或多個規(guī)則包括：基于峰面積確定18S峰和28S峰中的至少一個是否具 有不止一個最大值；根據28S峰和18S峰面積的相互比較，確定18S峰和28S峰所處的邊 界是否需要進行調整；調整18S峰和28S峰的寬度使其在一定的寬度范圍內；以及如果18S 峰和28S峰之間的距離大于距離閾值，那么則要調整18S峰和28S峰中的至少一個的位置。 在一些情況下，以下這兩個規(guī)則是任選的：調整18S峰和28S峰的寬度使其在一定的寬度范 圍內，以及如果18S峰和28S峰之間的距離大于距離閾值則要調節(jié)18S峰和28S峰中的至 少一個的位置。
[0206] -旦根據方法200限定了 18S峰和28S峰，就可以確定其它值，諸如中間面積、低 條帶面積等
[0207] 應當注意，在所述的每一個這些特征的組合中，無論是方法300還是方法400 (圖 12A中所述）均可用于限定18S峰和28S峰和其他區(qū)。如果采用方法400而不使用偏移區(qū)， 那么使用更寬的區(qū)來對18S峰和28S峰進行定位。
[0208] 在一個實施方案中，所述特征的組合包括中間面積與偏移28S區(qū)中的28S峰面積 和偏移18S區(qū)中的18S峰面積之和的比率，其可用表達式"中間A28S+18S) "來表示。
[0209] 在一個實施方案中，所述特征的組合包括低C條帶區(qū)面積和中間面積之和與偏移 28S區(qū)中的28S峰面積和偏移18S區(qū)中的18S峰面積之和的比率，其可以用表達式"（中間 + 低 CV(28S+18S)"來表示。
[0210] 在一個實施方案中，所述特征的組合包括低C條帶區(qū)面積和中間面積之和與偏移 28S區(qū)中的28S峰面積和偏移18S區(qū)中的18S峰面積之和的比率，其可用表達式"（低C+中 間V(28S+18S) "來表示。
[0211] 在一個實施方案中，所述特征的組合包括從至少兩個電泳圖譜數據集中確定的最 大比率。該比率被定義為中間面積除以分別在偏移的18S區(qū)和偏移的28S區(qū)中的18S峰面 積和28S峰面積之和。其可用表達式"最大中間A28S+18S) "來表示。
[0212] 在一些實施方案中，設備100和計算機可讀介質可配置成實施方法200和300或 方法200和400或方法200、300和400,其中方法400在圖12A中描述。
[0213] 在一個實施方案中，獲得至少一個電泳圖譜數據集的步驟包括：通過電泳分離細 胞RNA;檢測一種或多種已分離的細胞RNA;繪制電泳圖譜，并從電泳圖譜曲線圖中獲得至 少一個電泳圖譜數據集。
[0214] 用于分離RNA的電泳是一種常用技術。例如，含有熒光染料的凝膠可用于檢測 分離的RNA種類。已開發(fā)了用于分離RNA種類的自動化微流體基電泳的方法和系統(tǒng)，諸 如 Experion 自動電泳系統(tǒng)（Bio Rad Laboratories, Inc)和 Agilent 2100 生物分析儀 (Agilent Technologic, Inc)。這些系統(tǒng)使用非常少量的RNA，在電泳芯片通道中進行微毛 細管電泳。
[0215] 因此，所述凝膠電泳是微毛細管電泳。在另一個實施方案中，微毛細管電泳包括使 用用于電泳分離RNA的RNA芯片。
[0216] 通過例如使用RNA染料諸如與RNA結合的熒光染料，對分離的細胞RNA進行檢測。 RNA染料可添加到電泳凝膠中，以允許通過檢測染料信號來檢測RNA。
[0217] 試驗中所用的細胞RNA可以例如使用本領域公知的技術從生物樣品（包括任何包 含癌細胞的生物樣品，包括例如含有細胞系、人體組織或動物組織的細胞的樣品）中分離。 例如，細胞和/或活檢樣品可重懸/溶解于RNA分離或穩(wěn)定溶液中，諸如RNAzol TM(Sigmal/ Aldrich Co.)> RNAlater?(Qiagen Laboratories)、 RNA Stable?(Biomatrica Co.)、 RNA Protect Cell Reagent?(Qiagen Laboratories)，而分離 RNA 使用一種或多種可商 購的試劑盒（根據制造商的指導），其包括但不限于RNeasy?(Qiagen Laboratories)、 miRNeasy?(Qiagen Laboratories)>RNAzol?(Sigmal/Aldrich Co. )>Total RNA Isolation Kit(Norgen Biotek Co.和 Agilent Technologies Co.) > PureLink?(Invitrogen Labs)、 5PRIME PerfectPure?和 GeneJET (Thermo Scientific)試劑盒。
[0218] 正如所提到的，RNA斷裂的改變可以用于監(jiān)測對細胞毒性治療的響應。例如，圖 6A-6K、圖13、圖14A-D、圖15A-15D以及其它證明了 RDA可以用于將接受化療、具有增加的 pCR可能性的受試者從非響應者（即非pCR響應者）中區(qū)分出來，并且鑒定中間RDA區(qū)中的 患者。RNA斷裂的改變也見于輻射治療中（例如，參見圖10、圖11A和圖11B)。不希望受到 理論限制，腫瘤細胞中的RNA斷裂可發(fā)生在細胞死亡之前和/或細胞性改變之前，特別是在 治療的早期。因此，RDA適合用于評估對細胞毒性治療諸如化學治療的受試者響應。
[0219] 本發(fā)明的另一方面包括一種試驗，其包括：
[0220] 采用例如本文所述的用于確定RDA分數的RNA斷裂試驗（RDA)，對細胞毒性治療之 前、期間或之后的時間點上包含細胞腫瘤RNA的生物樣品中的RNA斷裂量進行量化，所述細 胞毒性治療例如但不限于化學治療、放射治療和細胞毒性佐劑治療；和
[0221] 確定所述細胞RNA的RNA斷裂量是增加還是不增加。
[0222] 正如所提到的，這包括確定受試者是否落入RDA區(qū)。例如，圖7A和圖14A，是雙對 數曲線圖，示出了可用RDA區(qū)將響應者和非響應者分開。
[0223] 在一個實施方案中，RDA區(qū)信息可以傳遞給受試者，任選通過醫(yī)務人員。
[0224] 腫瘤細胞RNA可來自于例如腫瘤細胞系，或可來自于受試者的腫瘤細胞樣品，諸 如活檢。
[0225] 在一個實施方案中，經評估的腫瘤細胞RNA來自未處理的樣品（例如，體外未處理 的腫瘤細胞）或者來自于治療之前（例如，治療前）的一個時間點上的受試者。
[0226] 顯現(xiàn)出異常18S/28S比率的腫瘤樣品已有報道。
[0227] 例如，已經報道了未處理的腫瘤組織中的異常28S:18S比率（Skrypina等人， 2003)。已經提出，28S中的這種損失是由于GC富集區(qū)內的優(yōu)選裂解（Johnson、Sendler、 Lalancette、Hauser、Diamond 和 Krawetz, 2011) 〇
[0228] 在一個實施方案中，細胞RNA從正常細胞中分離。例如，本發(fā)明的方法和試驗可用 于分析正常細胞對細胞毒性藥物例如但不限于化療藥物的響應，例如用于評估對非癌細胞 的藥物毒性。
[0229] 在一個實施方案中，所述確定步驟包括將生物樣品中量化的RNA斷裂量與對照諸 如閾值或參考值進行比較。在一個實施方案中，參考值對應于處理前的值。
[0230] 在一個實施方案中，所述增加是相對于對照或預期的處理前分數的。
[0231] 含有例如癌性腫瘤細胞RNA的處理前的樣品可包含相對少的RNA斷裂或不包含 RNA斷裂。例如，RNA完整性將是穩(wěn)定的。例如，使用本文所述方法已就RNA斷裂進行評估 的未處理乳腺癌腫瘤活檢樣品的RNA斷裂通常被鑒定為落入區(qū)1中。在一些實施方案中， 可對RNA降解進行評價而不涉及比較物（例如，使用絕對量級）。在一些實施方案中，可以 使用閾值?？梢允褂美缦薅艘粋€區(qū)的閾值來劃分受試者。因此，在預期的未處理的RNA 斷裂量的基礎上，即使不存在比較樣品，落入如區(qū)2或區(qū)3的RDA分數的確定就指征了該樣 品含有斷裂的RNA。因此，確定步驟可以包括與該腫瘤類型的先前確定值或預期值進行比 較。
[0232] 在另一個實施方案中，RNA斷裂試驗（RDA)用于測量癌癥的治療，例如化療和/或 輻射誘導的RNA斷裂。采用RDA的試驗可以用來鑒定哪些受試者和/或腫瘤對化療和/或 放射治療響應。
[0233] 因此，在另一實施方案中，該試驗進一步包括，如果RNA斷裂量（例如RDA分數） 相對于參考值或閾值增加，則將該腫瘤鑒定為為響應于癌癥治療，任選為化學治療和/或 放射治療。
[0234] 在另一個實施方案中，生物樣品與體外或體內治療的細胞，例如癌性腫瘤細胞相 對應。
[0235] 圖91表明敏感性A2780細胞顯現(xiàn)出RNA斷裂，而抗性A2780細胞則沒有。
[0236] 在本文所述的一個實施方案中還提供了一種用于確定癌性腫瘤細胞或正常細胞 對癌癥治療諸如化學治療和/或放射治療的敏感性的體外試驗，該方法包括：
[0237] 用化療劑和/或輻射來治療細胞或細胞群；
[0238] 采用本文所述的RNA斷裂試驗（RDA)，對用化療劑和/或輻射治療細胞或細胞群期 間或之后的時間點上包含細胞RNA的生物樣品中的RNA斷裂量進行量化，以任選確定RDA 分數；和
[0239] 將量化的RNA斷裂量與閾值或參考值進行比較，如果RNA斷裂量相對于參考值增 加，那么將該細胞鑒定為對化療和/或放射治療敏感，如果不增加（例如，如果不顯著增 加），那么將該細胞鑒定為對治療有抗性。
[0240] 在一個實施方案中，RNA斷裂表示為RDA分數。RDA分數是樣品中RNA斷裂量的反 映，增加的RDA分數反映增加的RNA斷裂。
[0241] 正如所提及的，所述試驗可用于確定受試者將會或者正在響應癌癥治療的可能性 和/或惡化的風險。
[0242] 因此，另一個實施方案包括一種用于確定受試者是否對癌癥治療響應的試驗，包 括：采用根據本文所述方法進行的RNA斷裂試驗（RDA)，就RNA斷裂量對受試者接受癌癥治 療期間和/或之后從受試者中取樣的生物樣品進行分析，所述癌癥治療任選為化學治療和 /或放射治療，其中如果RNA斷裂量（例如RDA分數）相對于閾值或參考值增加，那么該受 試者被鑒定為對治療響應。
[0243] 在一個實施方案中，響應性指征著治療效果，并且相對于閾值或參考值增加的RNA 斷裂量（指征著增加的化療誘導型RNA斷裂）預示著陽性治療效果，而相對于閾值或參考 值缺乏的RNA斷裂（例如，指征著很少或沒有化療誘導型的斷裂）預示著陰性治療響應（例 如缺乏長期益處）。
[0244] 在另一個實施方案中，陽性治療效果是治療后的病理完全響應、部分響應、疾病惡 化風險降低、疾病穩(wěn)定或總存活率提高。
[0245] 在一個實施方案中，經評估的癌性腫瘤樣品是治療期間和/或之后的從受試者中 取樣的，和/或時間點是治療期間和/或之后。
[0246] 在一個實施方案中，采用本文所述的方法或試驗用來監(jiān)測治療響應。例如，比較隨 后的樣品與先前的樣品，諸如基線樣品或值。在另一個實施方案中，在臨床試驗中采用本文 所述的試驗和方法來評估和/或監(jiān)測哪些受試者對治療響應。例如，可任選地基于表達分 析為受試者指定治療。
[0247] 活檢樣品可在治療期間和/或之后獲得，RDA可用于預測響應，例如，預測受試者 是否可能從繼續(xù)治療中受益（如其為響應者），或者可能從轉變治療中受益，從而對治療響 應、充足劑量等進行監(jiān)控。對于根據RDA來說不響應的受試者，子集可以轉變至新治療方 法。轉變的患者的效果可以與根據RDA分數預測無效的那些繼續(xù)治療的患者進行比較。
[0248] 因此，在一個實施方案中，所述方法或試驗進一步包括選擇非響應者，并使其隨機 參與兩個或多個臨床試驗組。
[0249] 在又另一個實施方案中，所述方法或試驗進一步包括選擇響應者，并使其隨機參 與兩個或多個臨床試驗組。
[0250] 另一方面，本公開包括一種用于為多組別臨床試驗選擇受試者的方法，該方法包 括：
[0251] 根據本文所述確定RDA分數的方法，預測接受細胞毒性治療諸如化學治療和/或 放射治療的受試者對該治療響應還是不響應；
[0252] 將非響應者隨機化到兩個或多個治療組；和
[0253] 任選將響應者隨機化到兩個或多個治療組。
[0254] 又一方面包括一種用于預測細胞毒性治療諸如化學治療和/或放射治療的功效 的方法，包括：
[0255] 將受試者組分層成至少2個亞組；
[0256] 采用化學治療對每個亞組的受試者進行治療一段合適的時間；
[0257] 根據本文所述的方法確定每個組的RDA分數；和
[0258] 如果受試者具有高于閾值或參考值的RDA分數，那么預測該治療是有效的，如果 受試者具有低于閾值或參考值的RDA分數，那么預測所述治療不是有效的。
[0259] 還提供了一種用于為受試者預測化療治療功效的方法，包括：
[0260] 采用化學治療對受試者進行治療一段合適的時間；和
[0261] 根據本文所述的方法確定RDA分數；
[0262] 其中，如果受試者具有高于閾值或參考值的RDA分數，那么該治療被預測為有效， 如果受試者具有低于閾值或參考值的RDA分數，那么該治療被預測為無效。
[0263] 如果受試者被鑒定為對細胞毒性治療不響應，那么可更改或改變受試者的治療。 例如，可以增加施用的治療劑量，可在治療方案中添加輻射和/或化療劑，或可以不繼續(xù)治 療，和/或啟動一項不同的細胞治療方案。所述方法和試驗也可用于對已改變的治療的響 應進行監(jiān)測。如果受試者對細胞毒性治療例如化學治療如放射治療或手術不響應，那么也 可以采用其它的治療模式。
[0264] 細胞毒性治療諸如化學治療和放射治療通常周期施用，其中所述周期可包括每段 時間施用1劑、2劑或更多劑，例如每1天、每1周、每2周的一段時間。已經針對不同藥物 和不同癌癥確立了方案。治療方案可包含1、2、3、4、5、6個或更多個周期。因此，在一個實施 方案中，RNA樣品是第一周期之后的一個時間點上的。在另一個實施方案中，所評估的RNA 樣品是從治療期間的受試者中取樣的，和/或時間點是治療期間的（例如，對于一個6個周 期的治療方案，所評估的RNA樣品是2、3或4個周期后從受試者中獲得的，和/或時間點是 2、3或4個周期之后）。
[0265] 在一個實施方案中，生物樣品是從已經接受第一周期的細胞毒性治療例如第一周 期的化學治療或放射治療之后取樣的。在另一個實施方案中，生物樣品是從已經接受2、3、 4個或更多個周期的治療后的受試者中取樣的。在又另一個實施方案中，生物樣品是完成治 療方案之后從受試者中取樣的。
[0266] 在一個實施方案中，生物樣品是活檢樣品如細針抽吸。在另一個實施方案中，生物 樣品包含從受試者中分離的癌細胞群。
[0267] 可以評估不止一個生物樣品。例如，多個生物樣品是在一個時間點上和/或同一 時間取樣的，例如，2個或多個細針抽吸活檢，可單獨對每個樣品進行評估，并對樣品的一致 性進行評估以確定治療響應中的任何異質性。
[0268] 在一個實施方案中，指征響應性和/或陽性治療效果的RDA分數與RNA完整性降 低（例如，RNA斷裂的增加）至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%或至少90%相關聯(lián)。
[0269] 在一個實施方案中，所述峰沒有偏移。然而，所述方法仍然可根據本文所述的方法 來實施。
[0270] 在一個實施方案中，本文所述的方法和試驗應用于非腫瘤RNA樣品，例如對藥物 敏感的正常細胞，例如對化療化學敏感和/或對放射治療輻射敏感。
[0271] 不希望受到理論的束縛，RNA斷裂被認為是一個在中間或非急性響應中的影響穩(wěn) 定細胞的過程。因此，所述方法、試驗和產品可應用于經受刺激誘導型細胞毒性如RNA斷裂 的任何細胞類型。
[0272] 已經證明Jurkat T白血病細胞系的總RNA對多柔比星的化學侵蝕異感 (Fimognari 等人，2〇〇9)。
[0273] 所述試驗可應用于任何腫瘤類型和/或亞型。例如，癌性腫瘤可以是乳腺癌、肺 癌、肉瘤、前列腺癌、結腸癌或卵巢癌，包括他們的任何亞型。在某一實施方案中，所述方 法和試驗應用于血癌，諸如白血病、多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤。在一個實施方案中，所述癌癥 是一種可用蒽環(huán)類藥物和/或紫杉烷和/或輻射治療的癌癥。例如，前列腺癌是一種可 用多西他賽治療的癌癥，而肺癌和肉瘤也可用蒽環(huán)類和/或紫杉烷類藥物治療。蒽環(huán)類 藥物包括例如多柔比星、柔紅霉素（daunorubicin)、表柔比星、伊達比星（idarubicin)、 戊柔比星（valrubicin)和米托蒽醌（mitoxantrone)。紫杉燒類藥物包括例如紫杉醇 (paclitaxel)、多西他賽、larotaxel、Abraxane、二十二碳六烯酸聯(lián)紫杉醇、多聚谷丙酸紫 杉醇（paclitaxel polyglumex)、Ortataxel、Genexol、脂質體包封的紫杉醇和維生素E乳 液中的紫杉醇。
[0274] 如圖10所示，癌細胞示出了響應于放射治療的RNA斷裂。圖11A和圖11B提供了 對其中患者接受了化學治療和放射治療的分析的描述。
[0275] 在一個實施方案中，受試者或細胞已接受了 1、2、3、4、5、6劑或更多劑的輻射。在 一個實施方案中，細胞和/或受試者在放射治療之前或同時用一定劑量化療劑治療。
[0276] MA22數據集包括例如具有不同￡1?、？1?、11從2、拓撲異構酶狀態(tài)的樣品。如實施例部 分所示，本文描述的方法和試驗可不依賴ER、PR、Her2、拓撲異構酶狀態(tài)實施。所述方法已 被用于評估ER、PR和Her2狀態(tài)不同的乳腺癌樣品，包括三陰性樣品。
[0277] 在一個實施方案中，癌性腫瘤選自乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和卵巢癌或其任何亞 型。
[0278] 在一個實施方案中，癌性腫瘤選自白血病、淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤和/或任何可 用蒽環(huán)類藥物和/或紫杉烷治療的癌癥。
[0279] 在一個實施方案中，癌性腫瘤是乳腺癌。
[0280] 在另一個實施方案中，乳腺癌是Her2+陽性乳腺癌。
[0281] 又一方面包括一種治療需要治療的患有癌癥的受試者的方法，包括：
[0282] 施用細胞毒性治療，任選為化學治療和/或放射治療；
[0283] 根據本文所公開的方法，確定該受試者是否對該治療響應；和
[0284] 若受試者響應，則繼續(xù)施用該治療，和/或若受試者不響應，則不繼續(xù)施用該治 療。
[0285] 在一個實施方案中，例如其中受試者樣品包括中間水平的RNA斷裂，例如RDA區(qū)2， 則增加細胞毒性治療劑量例如化學治療劑量。由于落入RDA區(qū)3的受試者更可能是病理完 全響應者，所以RDA分數不落入RDA區(qū)的受試者可從增加的治療劑量中獲益。
[0286] 在一個實施方案中，化療治療選自微管穩(wěn)定劑如多西他賽和紫杉醇、DNA合成抑制 劑如表柔比星、Her2受體抑制劑如曲妥單抗、DNA交聯(lián)劑如馬磷酰胺、卡鉬和順鉬、VEGFA抑 制劑如貝伐單抗、受體酪氨酸激酶抑制劑如舒尼替尼和托西尼布（Toceranib)、