一種新的細粒棘球絳蟲陽性抗原及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及寄生蟲病診斷領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種可用于診斷細粒棘球絳 蟲（或細粒棘球蝴）的新抗原。
[0002] 相關(guān)資助
[0003] 本發(fā)明受到以下基金的資助：國家自然科學(xué)基金（81201315);中國博士后基金 (2014M551331);國家重大科技專項（2009ZX10004-302);中國疾病預(yù)防控制中心青年基金 (2013A103);上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會科研課題（20124174)。
【背景技術(shù)】
[0004] 細粒棘球絳蟲（Echinococcusgranulosus)的幼蟲（棘球蝴）寄生于人體所引起 的細粒棘球蝴?。–ystechinococcosis)，也叫囊型包蟲病（Cystichydatiddisease)， 是一種嚴重危害人體健康和生命安全、影響社會經(jīng)濟發(fā)展的人獸共患病，是世界棘球蝴病 的主要疾病負擔，也是我國重點防治的寄生蟲病之一。該病呈全球性分布，具不完全報道， 全球至少100個國家存在細粒棘球絳蟲的流行。高度流行區(qū)主要在歐亞大陸，非洲的北 部和東部，澳大利亞及南美洲。我國是世界細粒棘球蝴病的高發(fā)區(qū)，預(yù)計我國該病的疾病 負擔占據(jù)全球的40%。2004年全國人體重要寄生蟲病調(diào)查表明，棘球蝴病的人均患病率 1. 08%，據(jù)估算我國有60~130萬棘球蝴病人，受威脅人口約6600萬，27個省、自治區(qū)、直 轄市有病例報道，98%是細粒棘球蝴病例，每年細粒棘球蝴病手術(shù)病例約2000例。
[0005] 目前對棘球蝴病的診斷主要以患者自述癥狀、醫(yī)生局部體檢為依據(jù)。由于細粒棘 球蝴呈封閉性寄生于人體的內(nèi)部臟器，傳統(tǒng)的病原學(xué)方法無法診斷，須輔以物理和其他實 驗方法。
[0006] 現(xiàn)行診斷主要以醫(yī)學(xué)影像法為判斷標準。B超診斷是目前棘球蝴病診斷與流行病 調(diào)查的主要方法，但采用B超進行疾病篩查仍存在問題。例如，對檢驗人員技術(shù)水平及經(jīng)驗 要求高，極易與肝癌、肝血管瘤及肝囊腫混淆，且很難對2厘米以內(nèi)的包囊進行準確診斷。
[0007] 免疫學(xué)檢測是人體棘球蝴病重要的輔助診斷方法。當包囊的影像學(xué)形態(tài)不典型 時，免疫診斷具有鑒別診斷的意義；免疫學(xué)檢測的敏感性和特異性對患者的及時發(fā)現(xiàn)與治 療后隨訪也起到了重要作用；對流行區(qū)的流行病學(xué)調(diào)查、防治規(guī)劃的制定及防治效果的考 核免疫學(xué)診斷更具有重要的參考價值。棘球蝴病血清學(xué)診斷有著長久的發(fā)展史，幾乎所有 已經(jīng)出現(xiàn)的免疫學(xué)診斷方法都被用于人體棘球蝴病診斷。然而，至今沒有一種可行的診斷 工具、試劑盒或方法可以普遍應(yīng)用到棘球蝴病臨床實踐中。提高人體棘球蝴病血清學(xué)診斷 試劑的檢測效能是我國棘球蝴病防治中亟待解決的問題。
[0008] 由于循環(huán)抗原檢測的低敏感性，抗體檢測仍然是棘球蝴病臨床診斷和流行病普查 中使用最廣泛的方法?？贵w檢測的敏感性和特異性與實驗中所用的抗原密切相關(guān)。細粒棘 球蝴病的抗原可來源于囊液、原頭蝴、囊壁。其中囊液抗原（HCF)研宄的最多，是目前最主 要的診斷抗原來源。囊液成分復(fù)雜，有蟲體分泌物及蟲體表面脫落的物質(zhì)，具有很強的抗原 性。但不同宿主及同一宿主的不同寄生部位，囊液的抗原性相差很大，據(jù)報道其敏感性可達 75%~95%，但其特異性不高，且常與其他絳蟲、線蟲和吸蟲有交叉反應(yīng)。此外，天然來源 的粗囊液成分復(fù)雜性，不宜于進行質(zhì)量控制和標準化，產(chǎn)量低，是目前細粒棘球蝴病血清學(xué) 診斷試劑效能低，產(chǎn)品不能標準化的重要原因。
[0009] 分析粗抗原組分，采用基因工程的方法制備重組抗原替代天然抗原，是解決上述 問題，提高細粒棘球蝴病診斷試劑效能的一種重要途徑?？乖瑽(AgB)是細粒棘球蝴包囊液 中含量最豐富的組分之一，其亞單位EgAgBl和EgAgB2的重組蛋白是目前公認的最有前景 的細粒棘球蝴病診斷抗原。目前報道的天然抗原B對囊型包蟲病診斷有一定的敏感性和特 異性，但往往敏感性較低，但AgB為基礎(chǔ)制備的多肽抗原如P176、P175、P177等雖然可以提 高診斷的特異性，但靈敏性往往降低。
[0010] 除此之外，也陸續(xù)有新的診斷抗原被發(fā)現(xiàn)，但到目前為止，這些已經(jīng)報道的抗原對 細粒棘球蝴病檢測的靈敏度和特異性在實際診斷中仍在很大局限性，無法滿足實際診斷的 要求。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種可有效提高細粒棘球蝴病診斷的靈敏度和特異性的 抗原。細粒棘球絳蟲LDH作為一種新的有效進行細粒棘球蝴病診斷的抗原尚未有報道。
[0011] 因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)一種可有效提高細粒棘球絳蟲的診斷靈敏度和特異性 的抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的目的就是提供一種可有效提高細粒棘球蝴病的診斷靈敏度和特異性的 抗原，及其制法和應(yīng)用。
[0013] 在本發(fā)明第一方面，提供了一種細粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶（Echinococcus granulosuslactatedehydrogenase，EgLDH)或其基因、或其檢測試劑的用途，它們被（i) 用于制備細粒棘球絳蟲（或細粒棘球蝴）的陽性抗原；和/或（ii)用于制備診斷細粒棘球 絳蟲（或細粒棘球蝴）的試劑或試劑盒。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的細粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶EgLDH選自下組：
[0015] (a)如SEQIDNO.: 1 所示的多肽；
[0016] (b)將SEQIDNO: 1氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基取代、缺失或添加而形 成的具有免疫原性的衍生多肽；
[0017] (c)與SEQIDNO:1所示氨基酸序列的同源性彡90%，較佳地彡95%的具有免疫 原性的多肽；或
[0018] (d)具有免疫原性的多肽（a)-(c)的片段。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原組合中的抗原針對的抗體不相同。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的EgLDH基因的GenBank登陸號為HM748917. 1
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的EgLDH基因的核苷酸序列如SEQIDNO. : 2所示。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽保留了SEQIDNO. :1所示多肽至少80%、90%、 95%以上的免疫原性。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的衍生多肽由SEQIDNO. : 1所示多肽經(jīng)1-50個，較佳地 1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個氨基酸取代、缺失或添加而形成，且所述的衍生多肽 具有免疫原性。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測試劑包括細粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶的抗體、檢測細 粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶編碼序列的探針、或其組合。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒含有一容器，所述的容器內(nèi)含有EgLDH或與EgLDH 特異性結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述容器內(nèi)含有與EgLDH特異性結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物作為 陽性對照。
[0027] 在本發(fā)明的第二方面，提供了一種抗體，所述的抗體能與SEQ ID NO. :1所示的多 肽特異性結(jié)合。
[0028] 在本發(fā)明的第三方面，提供了一種抗原-抗體復(fù)合物，所述的復(fù)合物包括：
[0029] ⑴SEQ ID NO.:1所示的多肽；
[0030] (ii)與（i)中的多肽特異性結(jié)合的抗體。
[0031] 在本發(fā)明的第四方面，提供了本發(fā)明第三方面所述抗原-抗體復(fù)合物的用途，它 被用于：
[0032] (a)制備檢測細粒棘球絳蟲（或細粒棘球蝴）的試劑或試劑盒；和
[0033] (b)用作檢測細粒棘球絳蟲（或細粒棘球蝴）的陽性對照。
[0034] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種細粒棘球絳蟲（或細粒棘球蝴）檢測試劑盒，其 特征在于，所述的試劑盒含有一容器，所述的容器中含有細粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶或其基 因。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括酶結(jié)合液、反應(yīng)底物和任選的說明書，較佳 地，所述的試劑盒還可包括選自下組的組分：反應(yīng)終止液、樣本稀釋液、和洗滌液。
[0036] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種診斷或非診斷性的檢測樣本中是否感染細粒棘 球絳蟲（或細粒棘球蝴）的方法，包括步驟：
[0037](1)制備SEQ ID NO.:1所示的細粒棘球絳蟲乳酸脫氫酶作為抗原；
[0038] (2)將步驟⑴中得到的抗原與待檢測樣本接觸；
[0039] (3)檢測樣本中是否含有本發(fā)明第三方面所述的抗原-抗體復(fù)合物；
[0040] 其中，若步驟（3)中的樣本出現(xiàn)所述的抗原-抗體復(fù)合物，則表明所述的樣本感染 了細粒棘球蝴絳蟲（或細粒棘球蝴）。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣本包括血液樣本（包括全血，血清，血漿樣本）、組織 液樣本、尿液樣本、唾液樣本、糞便樣本。
[0042] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0043] 圖1顯示了EgLDH基因PCR擴增結(jié)果。圖中各泳道如下：M:分子量標準，1 :