一種競爭性消耗致癌性microRNAs的LncRNA、溶瘤腺病毒及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程和病毒學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種競爭性消耗致癌性 microRNAs的LncRNA、溶瘤腺病毒及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤是以細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)的一大類疾病，在我國其發(fā)病率及死亡 率一直呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅國民的健康和生命。目前對惡性腫瘤的治療仍以常規(guī)的手 術(shù)、放療、化療為主，這種常規(guī)治療對絕大多數(shù)腫瘤來說，難以收到預(yù)期的療效，很重要的原 因是沒有特異的、敏感的早期診斷指標(biāo)以及缺乏有效的治療性分子靶標(biāo)，這成為改善腫瘤 患者臨床療效和預(yù)后的重要障礙。近年來的生物信息學(xué)分析表明，人類全部基因的三分之 一都受到microRNAs (miRNAs)的調(diào)控，表明miRNAs實(shí)際上是基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成分。 miRNAs分子小、數(shù)量多、作用廣，甚至可以說miRNAs在細(xì)胞內(nèi)、在人體內(nèi)無處不在。miRNAs 在多種生物進(jìn)程中起到關(guān)鍵作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞早期發(fā)育、細(xì)胞增殖、干細(xì)胞分化和凋亡。 關(guān)于miRNAs對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用及其在腫瘤診斷治療中的重要作用受到人們的關(guān) 注。研究表明，miRNAs表達(dá)譜的改變參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的整個過程，包括腫瘤細(xì)胞的起源、 侵襲及轉(zhuǎn)移。因此，miRNAs對腫瘤靶向治療的價值不可估量。
[0003] miRNAs是一類長度為18-22個核苷酸、高度保守的小分子非編碼RNA，廣泛存 在于真核細(xì)胞中。miRNAs基因在細(xì)胞核內(nèi)由RNA轉(zhuǎn)錄酶作用先生成miRNAs轉(zhuǎn)錄前體 (pri-miRNAs)，然后pri-miRNAs在RNA聚合酶III作用下，剪切生成約70個核苷酸長度的 miRNAs前體（pre-miRNAs)。之后，pre-miRNA被轉(zhuǎn)運(yùn)由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，經(jīng)過DICER酶 加工，生成約18-22個核苷酸的單鏈RNA分子，即成熟的miRNAs。miRNAs選擇性地與RNA 介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex, RISC)特異結(jié)合，形成RISC復(fù)合物， 發(fā)揮生物學(xué)功能。成熟的miRNAs可與其他蛋白質(zhì)一起組成RISC復(fù)合體，通過核酸序列互 補(bǔ)結(jié)合于靶基因mRNAs，發(fā)揮抑制靶基因mRNA翻譯或降解靶基因mRNA的作用，從而發(fā)揮其 對靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)效應(yīng)。miRNAs廣泛參與生物體生命過程中的許多重要進(jìn)程，包括 個體發(fā)育、器官形成以及細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，同時也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn) 移。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs的異常表達(dá)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)。有超過一半的 miRNAs位于腫瘤相關(guān)基因組區(qū)域或脆性位點(diǎn)、雜合性丟失區(qū)和擴(kuò)增區(qū)，提示miRNAs可能作 為致癌性miRNAs (致癌性microRNAs, OncomiRs)或抑癌性miRNAs而發(fā)揮作用。miRNAs有 可能通過引起某些凋亡相關(guān)因子表達(dá)的變化、影響各種細(xì)胞內(nèi)外信號通路的活性、調(diào)控基 因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中。不同人類腫瘤的miRNAs表達(dá)譜，在 乳腺癌、肝癌、肺癌、大腸癌、腦瘤、白血病等多種腫瘤中均發(fā)現(xiàn)特異性miRNAs的高表達(dá)，這 些miRNAs被視作一類OncomiRs。miR-155在慢性淋巴細(xì)胞性白血病、何杰金氏淋巴瘤、B 細(xì)胞淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和甲狀腺癌中的表達(dá)上調(diào)，預(yù)示這些疾病患者治療后難 以緩解。miR-17-92家簇（miR-17-5p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-l、 miR-92-l)的高表達(dá)，可作為多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后不良的標(biāo)志物，并能夠促進(jìn)B細(xì)胞淋巴瘤的 惡性發(fā)展。腫瘤細(xì)胞中某些miRNAs表達(dá)下調(diào)甚至缺失，也可能導(dǎo)致腫瘤，這類miRNAs可視 作抑癌基因。如let-7表達(dá)下調(diào)與腫瘤發(fā)生有關(guān)，miR-15和miR-16與慢性淋巴細(xì)胞性白 血病相關(guān)，miR-26a、miR-129、miR-143和miR-145在乳腺癌、如列腺癌、宮頸癌、淋巴系統(tǒng) 腫瘤及大腸癌中低表達(dá)，miR-122表達(dá)下降可能介導(dǎo)原發(fā)性肝癌的發(fā)病過程。miR-34包括 miR-34a、miR-34b和miR-34c等，在多種腫瘤中都呈現(xiàn)非正常的低表達(dá)。這些miRNAs表達(dá) 水平的改變，與癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。
[0004]以肝癌為例，通過文獻(xiàn)檢索，篩選出在肝癌中高表達(dá)的miRNAs有miR-21、 miR-221/222、miR-224、miR-17-5p、miR-10b、miR-106b、miR-15卜5p、miR-155、 miR-181a/181b、miR-184,此外在乙肝病毒相關(guān)的肝癌中還可檢出miR-1和miR-449a。通 過比較侵襲性和非侵襲性肝癌的miRNAs表達(dá)譜，還發(fā)現(xiàn)20種miRNAs與肝癌轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù) 發(fā)相關(guān)，其中上調(diào)表達(dá)的有砧1?-185、11111?-219-1、11111?-207、11111?-338;下調(diào)表達(dá)的有1^卜78、 miR-1-2、miR-122、miR-124a_2、miR-125b_2、miR-126、miR_148a、miR_148b、miR_15a、 miR-194、miR-19a、miR-30a、miR-30c-l、miR-30e、miR-34a、miR-9-2,它們在肝癌的發(fā)生發(fā) 展中分別起不同的作用。肝癌中miR-21高表達(dá)可抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)。PTEN蛋白 是3-磷酸肌醇激酶（phosphoinositide 3_kinase，PI3K)/絲/蘇氨酸蛋白激酶（serine/ threonine kinase，AKT)通路的重要抑制蛋白，因此，miR-21抑制PTEN的后果即是激活 PI3K/AKT通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移。miR-221/222作用于許多關(guān)鍵的腫瘤抑制因子， 包括Bmf、p27Kipl、p57Kip216、PTEN、金屬蛋白酶-3的組織抑制因子TMP-3以及DNA損 傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄子4 (DDIT4)，從而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展?？傊伟┲衜iR-21、miR-221/222、 miR-224、miR-17-5p、miR-10b、miR106b、miR-151-5p、miR-155、miR-181a/181b、miR-184高 表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移；miR-221/222、miR-224、miR-10b、miR-155高表達(dá)能 夠抑制癌細(xì)胞凋亡；miR-21、miR-221/222、miR-143、miR-1、miR-449a高表達(dá)能夠促進(jìn)乙肝 病毒增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞癌變和增強(qiáng)癌細(xì)胞增殖活性。
[0005]腫瘤細(xì)胞與其起源的相應(yīng)正常細(xì)胞之間miRNA表達(dá)譜的差異，不同腫瘤之間 miRNA表達(dá)譜的特異性，以及miRNAs在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過程中起到的作用，為 腫瘤的生物治療提供了有用的分子靶標(biāo)，可通過調(diào)控miRNAs的表達(dá)來治療腫瘤。近來，以 miRNAs為靶點(diǎn)的腫瘤治療方案有很多報道，給腫瘤的治療帶來了希望。對于在腫瘤細(xì)胞中 高表達(dá)的OncomiRs，已有研究采用miRNAs抑制劑或反義序列封閉miRNAs的表達(dá)，抑制腫瘤 生長。但是，現(xiàn)有的治療性研究大多針對單一miRNA或者miRNAs家族。由于miRNAs作用 的靶基因眾多，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，一個miRNA可以靶向多個靶基因，一個靶基因也可能受多種 miRNAs的調(diào)控，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展一定涉及很多miRNAs分子，調(diào)控廣泛的靶基因或者影響 很多信號途徑。因此，單一miRNA表達(dá)的干預(yù)對腫瘤的抑制效果有限，癌細(xì)胞很容易通過旁 路信號途徑重新獲得增殖活力。
[0006]腫瘤特異性增殖腺病毒能夠特異性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量增殖復(fù)制，溶解破壞 腫瘤細(xì)胞，釋放子代病毒，感染更多的腫瘤細(xì)胞，故又稱之為溶瘤腺病毒（Oncolytic adenovirus)。利用腫瘤特異性增殖腺病毒的高彌散力、高轉(zhuǎn)染力以及在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異 性增殖復(fù)制的能力，可使其攜帶的抗癌基因拷貝數(shù)隨病毒增殖而增加，在腫瘤細(xì)胞中獲得 商轉(zhuǎn)染率、商拷貝數(shù)及商效表達(dá)的抗癌因子，提商對腫瘤的抗癌效應(yīng)。由于腺病毒是目如 腫瘤基因治療的常見的、安全的病毒載體，已廣泛地應(yīng)用于人體基因治療方案中，具有以下 優(yōu)點(diǎn)：基因組完全清楚，易于操作；能感染的人類細(xì)胞廣泛，可高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的人組 織細(xì)胞，包括靜止期細(xì)胞；病毒滴度較高，在細(xì)胞培養(yǎng)物中有高滴度的重組病毒產(chǎn)量；基因 組大，因而可插入大片段外源基因；進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，因而安全性較 高，無致癌性。中國國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA) 2004年和2005年已批準(zhǔn)了2個腺病 毒產(chǎn)品上市，臨床應(yīng)用至今未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用。
[0007]目前，還未見報道采用腫瘤特異性增殖腺病毒介導(dǎo)人工設(shè)計的LncRNA在癌細(xì)胞 中特異性增殖，隨腺病毒的增殖復(fù)制，以實(shí)現(xiàn)高拷貝、高效率表達(dá)LncRNA，提高其競爭結(jié)合 miRNAs的效果，全面保護(hù)多種OncomiRs的祀基因，最終發(fā)揮更有效的抗癌效應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于提供一種可用于肝癌等多種腫瘤治療的競爭性消耗OncomiRs 并實(shí)現(xiàn)多種miRNAs聯(lián)合干預(yù)的LncRNA、可在癌細(xì)胞內(nèi)特異性增殖復(fù)制并表達(dá)所述LncRNA 的溶瘤腺病毒。
[0009]本發(fā)明提供了一種競爭性消耗OncomiRs的LncRNA，所述的LncRNA的序列為SEQ ID N0. 4所示序列的n個拷貝，其中，n為大于等于1的整數(shù)。
[0010] 作為本發(fā)明