[0061] 實施例2表達人工合成的長鏈非編碼RNA(LncRNA)的腺病毒包裝質(zhì)粒的構(gòu)建
[0062]第一步：克隆獲得鼠巨細胞病毒（CMV)啟動子序列，5' -端引入BamHI位點， 3'_端引入Sail位點，插入質(zhì)粒pDC315的BamHI+Sall位點，構(gòu)建成含mCMV啟動子的質(zhì)粒pDC315-mCMV。mCMV序列長543bp，其中，第l-6bp 酶切位點（GGATCC);第7-537bp : 鼠巨細胞病毒（CMV)啟動子序列（SEQ ID N0. 6);第538-543bp :SalI酶切位點（GTCGAC)。
[0063]第二步：人工合成編碼LncRNA的6個拷貝的DNA序列（含PolyA加尾序列），5'_端 和3' -端均引入SalI位點，插入pDC315-mCMV的SalI位點，構(gòu)建成含LncRNA編碼序列的表 達質(zhì)粒pDC315_mCMVLncR。編碼LncRNA的DNA序列（含PolyA加尾序列）長1348bp，其中， 第l-6bp :SalI酶切位點（GTCGAC);第7-13bp :轉(zhuǎn)錄起始位點（CACCATG);第14-1192bp : 含有6個重復拷貝的LncRNA編碼序列（SEQ ID N0. 12);第1193-1352bp :LncRNA加尾序列 (SEQ ID NO. 13);第1353-1358bp :SalI酶切位點（GTCGAC)。
[0064]第三步：PDC315-mCMVLncR經(jīng)BamHI+Sall酶切，回收含有LncRNA完整表達框的片 段，插入pDC315-SVPEla質(zhì)粒的BamHI+Sall位點，構(gòu)建攜帶LncRNA編碼序列的腫瘤特異性 增殖腺病毒包裝質(zhì)粒pDC315-SVPEla-mCMVLncR。LncRNA完整表達框全長1895bp，其中，第 l-6bp :BamHI酶切位點；第7-537bp:鼠巨細胞病毒（CMV)啟動子序列（SEQ ID N0. 6);第 538-543bp :SalI酶切位點；第544-550bp :轉(zhuǎn)錄起始位點（CACCATG);第551-1729bp:含有 6個重復拷貝的LncRNA編碼序列（SEQ ID N0. 12);第1730-1889bp :LncRNA加尾序列（SEQ ID NO. 13);第1890-1895bp :SalI酶切位點。
[0065]實施例3攜帶LncRNA編碼序列的腫瘤特異性增殖腺病毒的重組、擴增和純化
[0066]第一步：將構(gòu)建好的5型腺病毒左臂包裝質(zhì)粒pDC315-SVPEla-mCMVLncR與5 型腺病毒右臂包裝質(zhì)粒pBHGloxdelE13cre通過LipoFectamine2000共轉(zhuǎn)染HEK293細 胞。轉(zhuǎn)染具體方法步驟參見Invitrogen公司的LipoFectamine2000試劑盒操作說明 書。質(zhì)粒pBHGloxdelE13cre和HEK293細胞株為加拿大Microbix Biosystems公司產(chǎn)品。 pBHGloxdelE13cre含有5型腺病毒右臂，缺失El、E3區(qū)，其重組酶系統(tǒng)Cre/LoxP可以保 證病毒的高效重組。HEK293細胞由剪切的5型腺病毒DNA轉(zhuǎn)化，含5型腺病毒E1區(qū)，腺 病毒DNA對其具有高轉(zhuǎn)染效率，能夠促進腺病毒的重組和包裝。在載體共轉(zhuǎn)染后的14天 出現(xiàn)病毒空斑，經(jīng)過三次病毒空斑純化（具體方法參見GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press, Clifton, New Jersey),重組出腺病毒 AdSVPEla-lncR。
[0067]完整的腺病毒AdSVPEla-lncR基因組序列如SEQ ID NO. 10所示。其中： (l)l-85bp :5型腺病毒ITR序列；（2)86-437bp :5型腺病毒基因組序列；（3)438-443bp: Xbal酶切位點；（4)444_1433bp :Survivin啟動子序列；（5) 1434_1439bp :EcoRI酶 切位點；（6) 1440-2428bp :Ela基因cDNA序列；（7)2429-2738bp :SV40PolyA加尾序 列；（8) 2739-2744bp 酶切位點；（9) 2745-3275bp :鼠巨細胞病毒（CMV)啟動 子序列；（l〇)3276-3281bp :SalI酶切位點；（ll)3282-3288bp :LncRNA轉(zhuǎn)錄起始位 點；（12)3289-4467bp:含有6個重復拷貝的LncRNA編碼序列；（13)4468-4627bp : LncRNA加尾序列；（14)4628-4633bp :SalI酶切位點；（14)4634-4668bp :LoxP序列； (15) 4669-34339bp :5型腺病毒基因組序列；（16) 34340-34441bp :5型腺病毒ITR序列。
[0068]第二步：腺病毒AdSVPEla-lncR在HEK293細胞中大量繁殖，應(yīng)用氯化銫梯度離心 的方法大量純化腺病毒（具體方法參見GeneTransfer and Expression Protocols，Murray EJ主編，Humana Press, Clifton, New Jersey)〇
[0069]實施例4重組腺病毒AdSVPEla-lncR的鑒定
[0070]重組腺病毒AdSVPEla-lncR的插入序列通過測序和PCR證實。AdSVPEla-lncR為5 型腺病毒，插入序列包括6個拷貝的LncRNA編碼序列、mCMV啟動子、Survivin啟動子、Ela 序列，其他DNA序列與5型腺病毒相同。鑒定所用PCR引物如表1所示：
[0071]表1?重組腺病毒AdSVPEla-lncR鑒定的PCR引物
[0072]
【主權(quán)項】
1. 一種競爭性消耗致癌性microRNAs的LncRNA，其特征在于，所述的LncRNA的序列為 SEQ ID NO. 4所示序列的η個拷貝，其中，η為大于等于1的整數(shù)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述的LncRNA的編碼序列，其特征在于，所述的編碼序列為SEQ ID NO. 1所示序列的η個拷貝，其中，η為大于等于1的整數(shù)。
3. -種溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒的基因組中整合有權(quán)利要求1所 述的LncRNA的表達盒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的LncRNA的表達盒包含權(quán)利 要求2所述的LncRNA的編碼序列，以及調(diào)控LncRNA的編碼序列表達的啟動子，所述的調(diào)控 LncRNA的編碼序列表達的啟動子插入在所述LncRNA的編碼序列的轉(zhuǎn)錄起始位點之前。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒的基因組中含 有病毒增殖必需基因和調(diào)控所述病毒增殖必需基因表達的腫瘤特異性啟動子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒是以人類5型 腺病毒為基礎(chǔ)構(gòu)建而成；所述的調(diào)控LncRNA的編碼序列表達的啟動子序列如SEQ ID NO. 6 所示，所述的病毒增殖必需基因序列如SEQ ID NO. 8所示，所述的腫瘤特異性啟動子序列如 SEQ ID NO. 7 所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的溶瘤腺病毒的全基因組序 列如SEQ ID NO. 10所示。
8. 權(quán)利要求1所述的LncRNA、權(quán)利要求2所述的LncRNA的編碼序列或權(quán)利要求3-7 任一所述的溶瘤腺病毒在制備藥物中的用途，其特征在于，所述的藥物用于治療腫瘤。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤中miR-21、miR-221/222、 miR-224、miR-17-5p、miR-10b、miR106b、miR-151-5p、miR-155、miR-181a/181b、miR-184、 miR-1和/或miR_449a高表達。
10. 權(quán)利要求1所述的LncRNA、權(quán)利要求2所述的LncRNA的編碼序列或權(quán)利要求3-7 任一所述的溶瘤腺病毒在制備試劑中的用途，其特征在于，所述的試劑用于研究肝癌細胞 中的分子作用機制或/和肝癌的治療。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種競爭性消耗致癌性microRNAs(OncomiRs)的LncRNA、溶瘤腺病毒及其用途。本發(fā)明人工合成了可聯(lián)合干預(yù)多種OncomiRs的LncRNA的編碼序列，以溶瘤腺病毒為載體表達該LncRNA，并利用腫瘤特異性的Survivin基因啟動子調(diào)控溶瘤腺病毒增殖必需基因E1a，使病毒在癌細胞內(nèi)特異性增殖復制，隨腺病毒在癌細胞內(nèi)特異性高拷貝復制，實現(xiàn)LncRNA在癌細胞內(nèi)大量表達和高拷貝積累，通過與OncomiRs的靶基因競爭性結(jié)合并消耗OncomiRs，從而保護大量的抑癌基因免受OncomiRs的干擾和抑制，實現(xiàn)對癌細胞的靶向干預(yù)治療，具備療效好、安全性高的優(yōu)勢。
【IPC分類】C12N15-11, A61K48-00, C12N15-113, C12N7-01, A61K31-7088, A61P35-00, A61K35-761
【公開號】CN104651364
【申請?zhí)枴緾N201510056926
【發(fā)明人】蘇長青, 李曉雅, 季衛(wèi)丹
【申請人】中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月4日