[0072] 1.4結果
[0073] 前期的RNA-seq測序結果共篩選出979個差異表達基因，其中表達水平上調的基 因472個，表達水平下調的基因507個。
[0074] 實施例2大樣本PCR驗證候選基因與骨肉瘤的關系
[0075] 考慮現(xiàn)有技術中還未見關于該基因與骨肉瘤相關性進行研宄的基因作為候選基 因，同時考慮前期高通量轉錄組深度測序的結果，根據(jù)Pvalue的大小選擇C8orf59基因 (其表達在骨肉瘤組織中上調）進行驗證。收集30個骨肉瘤組織，同時收集20個正常骨組 織樣本，采用PCR進行經典的分子生物學實驗驗證，具體操作步驟如下所示：
[0076] 1、RNA提取
[0077] 收集樣本后凍存于液氮，取出后把組織放入已預冷的研缽中進行研磨，待組織樣 本成粉末狀后：
[0078] ①加入Trizol，室溫保存5min ;
[0079] ②加氯仿0? 2ml，用力振蕩離心管，充分混勾，室溫下放置5min-10min;
[0080] ③12000rpm高速離心15min后吸取上層水相（吸70%)到另一新離心管中，注意 不要吸到兩層水相之間的蛋白物質。移入新管，加入等體積的_20°C預冷異丙醇，充分顛倒 混勾，置于冰上lOmin;
[0081] @ 12000印111高速離15111；[11后小心棄掉上清液，按11111/11111'1^201的比例加入75% DEPC乙醇洗滌沉淀（4°C保存），洗滌沉淀物，振蕩混合，4°C下12000rpm高速離心5min;
[0082] ⑤棄去乙醇液體，室溫下放置5min以充分晾干沉淀，加入DEPC處理過的水溶解沉 淀；
[0083] ⑥用Nanodrop2000紫外分光光度計測量RNA純度及濃度，凍存于-70°C。
[0084] 2、逆轉錄
[0085] 用逆轉錄緩沖液對1yg總RNA進行逆轉錄合成cDNA。采用25y1反應體系，每 個樣品取1yg總RNA作為模板RNA，在PCR管中分別加入以下組分：DEPC水，5X逆轉錄緩 沖液，10mmol/LdNTP，0.1mmol/lDTT，30ymmol/lOligodT，200U/ylM-MLV，模板RNA。 42°C孵育lh，72°C10min，短暫離心。
[0086] 3、RT_PCR擴增
[0087]C8orf59:正向引物為 5'-TACGGCTCGTGAGCGGAAT-3'（SEQIDNO:1);
[0088] C8〇rf59 :反向引物為 5' -GGGATAAGTGAITTAATATCC-3'（SEQIDNO:2);
[0089] 0-actin:正向引物為 5' -CATCCTGCGTCTGGACCT-3'（SEQIDNO:7);
[0090] 0-actin:反向引物為 5' -GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3'（SEQIDNO:8) 〇
[0091] 反應混合物中各成分：正向引物、反向引物、10XPCR緩沖液、MgCl2、dNTP、TaqDNA 聚合酶、cDNA模板的量為分別為0. 2、0. 2、0. 4、0. 4、1. 0、1. 0、0. 2、0. 1和5yL，最后補充雙 蒸水使反應體系為10yL。PCR的反應條件如下：94°C，5min預變性；94°C，30s變性；55°C， 30s退火；72°C，30s延伸；共35個循環(huán)，電泳檢測PCR擴增產物。以DNA條帶的亮度來衡量 DNA量，條帶越亮，代表DNA量越多。以0-actin作內參對照，將C8orf59基因擴增產物的 條帶的亮度進行均一化處理，比較正常骨組織和骨肉瘤組織中C8orf59基因擴增產物的亮 度的比值。結果如圖1所示，與正常骨組織相比，C8orf59基因在骨肉瘤組織的表達上調， 同RNA-sep結果一致。
[0092] 4、QPCR擴增
[0093] 采用25yL反應體系，每個樣本設置3個平行管，所有擴增反應均重復三次以上以 保證結果的可靠性。配制以下反應體系：SYBRGreen聚合酶鏈式反應體系12. 5yL，正向 引物（5nmol/y1) 1yL，反向引物（5nmol/y1) 1yL，模板cDNA2. 0yL，雙蒸水 8. 5yL; 擴增08〇"59基因的正向引物序列為5'417〇：11^60460611^1'-3'（5￡0 10勵：3)，反向 增管家基因的正向引物序列為5'-(：1'(^66了4446了664了411^1'-3'（5￡〇10勵 ：9)，反向引物 序列為5'-66了66441^^了417664404-3'（3￡〇10勵：10)。各項操作均于冰上進行。擴增 程序為：95°C10min，（95°C15s，60°C60s)*45個循環(huán)。以SYBRGreen作為熒光標記物，在 LightCycler焚光實時定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條 帶，AACT法進行相對定量。結果如圖2所示，與正常骨組織相比，C8orf59基因在骨肉瘤 組織中的表達上調，同RNA-s印結果一致。
[0094] 實施例3免疫檢測樣本中C8orf59蛋白的表達變化
[0095] 1.抗原蛋白獲得
[0096] 利用基因工程表達：可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人C8orf59基因的cDNA序列，通 過PCR擴增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達載體中，表達C8orf59蛋白，并按基 因工程表達產物的純化體系純化蛋白質。
[0097] 2.抗體制備
[0098] 可采用以下幾種方法制備抗體：
[0099] (1)細胞融合法：用上述制備的C8orf59蛋白免疫動物（包括兔子、山羊等），獲得 脾臟細胞，再與骨髓瘤細胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術制備單克隆抗體。
[0100] (2)利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達成基因工程 單克隆抗體。
[0101] (3)利用純化的蛋白質免疫動物，制備多抗血清。
[0102] 3?檢測
[0103] (1)用制備的抗體（多抗或單抗），用組織化學方法進行骨肉瘤的病理檢測，陽性 信號為骨肉瘤。
[0104] (2)取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應為骨肉瘤可疑病人。
[0105] (3)將C8orf59抗體作為蛋白質芯片的探針之一，用于骨肉瘤診斷。
[0106] 實施例4C8orf59基因表達對骨肉瘤細胞生理活動的影響
[0107] 1. siRNA干擾效率的檢測
[0108] 1. 1細胞培養(yǎng)
[0109] 以人骨肉瘤U20S細胞系為研宄對象，人骨肉瘤U20S細胞系購自上海細胞庫，細胞 培養(yǎng)用含10%胎牛血清的頂DM培養(yǎng)基，在不含青霉素、鏈霉素的環(huán)境下，于體積分數(shù)為5% 的C02、37°C條件下常規(guī)培養(yǎng)。U20S細胞置顯微鏡下觀察到細胞貼壁生長，體積中等，大小 均勻，細胞呈橢圓形或不規(guī)則形，胞質較少，細胞核較大，核仁清晰。
[0110] 1. 2siRNA干擾C8orf59 基因表達
[0111]針對C8orf59的siRNA序列（siRNA-C8orf59):
[0112] 正義鏈 5'-UGUUCUUGGCCAUUGUCAGAA-3'（SEQIDNO:5);
[0113] 反義鏈為 5' -CUGACAAUGGCCAAGAACAAA-3'（SEQIDNO:6)。
[0114]陰性對照siRNA序列（siRNA-NC):
[0115] 正義鏈為 5' -CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'（SEQIDNO:11);
[0116] 反義鏈為 5' -UCGAAGUAUUCCGCGUACG-3'（SEQIDNO:12)。
[0117] 將細胞按IX104/孔接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，在37°C、5% 0)2培養(yǎng)箱中細胞培 養(yǎng)24h，在無雙抗、含10%FBS的頂EM培養(yǎng)基中，轉染按照脂質體轉染試劑2000(購自于 Invitrogen公司）的說明書轉染，實驗分為陰性對照組和實驗組（20nM)，其中陰性對照組 siRNA與C8orf59基因的序列無同源性，濃度為20nM/孔。同時分別轉染。
[0118] 1. 3QPCR檢測C8orf59基因的轉錄水平
[0119] 1. 3. 1細胞總RNA的提取
[0120] 采用TRIzolReagent(InvitrogenCat.No. 15596-018)總RNA提取試劑，按說明 書提供方法提取U20S細胞的總RNA。具體方法為：取細胞，用濃度為0. 01M的PBS沖洗3 次，加入適量TRIzol試劑，室溫放置5min裂解細胞，吹打均勻后以lmL/管分裝至1. 5mL Eppendorf管中。每管加入0? 2mL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2_3min，4°C、12000r/min 離心15min，將上層水相移至干凈Eppendorf管中，加入0. 5mL異丙醇，輕輕混勾，室溫放置 10min，4°C、7500r/min離心 10min。棄上清，75% 乙醇洗絳RNA沉淀，7500r/min離心 5min， 室溫干燥RNA沉淀，5-10min后溶于適量DEPC水。質量分數(shù)為1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳檢 測RNA樣本的完整性，應用Bio-Photometer對提取的RNA進行定量測定。
[0121] 1. 3. 2逆轉錄步驟同實施例2。
[0122] 1. 3. 3QPCR擴增步驟同實施例2。
[0123] 1.4 結果
[0124] 結果如圖3顯示，siRNA-C8orf59能有效抑制C8orf59基因的表達。
[0125] 2.C8orf59基因對骨肉瘤細胞增殖的影響
[0126] 細胞體外增殖使用MTT法檢測。
[0127] 2.1 步驟：
[0128] 將5X103個細胞鋪入96孔板并培養(yǎng)過夜，次日轉染陰性對照RNA或 siRNA-C8orf59,并于轉染后他、2411、4811、7211、9611、12011、14411進行]\〇'1'檢測。首先，棄去培 養(yǎng)上清，換入100UL含MTT0.5mg/ml(Sigma公司）的新鮮培養(yǎng)基；然后37°C孵育4h;最后 換入100yLDMSO(Sigma公司）并振蕩10min。最終吸光度使用490nm波長檢測，繪制細胞 生長曲線。
[0129] 2.2結果
[0130] 結果如圖4所示，抑制C8orf59表達后，骨肉瘤細胞U20S的生長明顯受到抑制，表 明C8orf59基因參與了骨肉瘤細胞的增殖過程。
[0131] 3. C8orf59基因對細胞凋亡的影響
[0132] 使用流式細胞儀檢測C8orf59基因對細胞凋亡的影響。
[0133] 3. 1 步驟
[0134] 按照前面描述的方法進行細胞轉染，轉染72h后，使用預冷PBS洗滌細胞，然后用 0. 25%胰酶消化細胞，中止消化，將離心收集的細胞使用PBS重懸，將細胞定量為IX106個 /ml，取200yL上述細胞懸液放置到Appendorf管中，加入10yLAnnexin-V-FITC混勻，室 溫暗處孵育染色15min，上機前5min加入10mg/L碘化丙錠（PI)染色5yL。未轉染siRNA 的細胞分別用Annexin-V-FITC和PI染色用于標準定量。用FACS流式細胞