儀進(jìn)行雙色熒 光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)，觀察凋亡細(xì)胞百分比。
[0135] 3. 2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0136] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P < 〇.〇5時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0137] 3. 3 結(jié)果
[0138]C8orf59基因干擾組的細(xì)胞凋亡率為（45. 23+2. 53) %，陰性對照組的細(xì)胞凋亡率 為（7. 33+0. 26) %，上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0. 05)，上述結(jié)果表明抑制C8orf59基因 的表達(dá)能明顯促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞U20S的凋亡。
[0139]4. C8orf59基因?qū)侨饬黾?xì)胞迀移能力的影響
[0140] 采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測C8orf59基因?qū)侨饬黾?xì)胞迀移能力的影響。
[0141] 4. 1具體步驟
[0142] (1)選用含有15y g/ml纖維蛋白原的PBS涂蓋5cm大小的培養(yǎng)皿過夜。
[0143] (2)第二天加入含有10%FBS的MDM，在紫外線下滅菌數(shù)小時(shí)后使用。
[0144](3)將U20S細(xì)胞按照前面描述的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72h后，按照1 X 106個(gè) 細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)對細(xì)胞進(jìn)行接種培養(yǎng)，24h后，觀察細(xì)胞是否生長均勻。
[0145] (4)用細(xì)胞刮在培養(yǎng)皿的細(xì)胞中間劃開一條痕跡，將其放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 后觀察細(xì)胞在劃痕中的迀移能力，每次觀察的時(shí)候選擇3個(gè)樣本，觀察3次。
[0146] 4. 2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0147] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P < 〇.〇5時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0148] 4. 3 結(jié)果
[0149] 侵襲實(shí)驗(yàn)開始24h后，C8orf59基因干擾組和陰性對照組的劃痕愈合率的平均值 分別為28%、75%，上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05)，表明抑制C8orf59基因的表達(dá)， 骨肉瘤細(xì)胞U20S的迀移能力下降。
[0150]5. C8orf59基因?qū)侨饬黾?xì)胞侵襲能力的影響
[0151] 使用Transwell侵襲小室測定法檢測C8orf59基因?qū)侨饬黾?xì)胞侵襲能力的影 響。
[0152] 5. 1具體操作步驟為：
[0153] (1)預(yù)先把Matrigel (Beeton-Diekinson，F(xiàn)ranklnLakes，NJ)用4°C的IMDM稀釋 至200 y g/ml，取200 y L稀釋的MDM放置在孔徑為8 y m的Transwell上。
[0154] (2)使聚碳脂膜膜上全部的微孔都要被Matrigel覆蓋，然后把其放在37°C的條件 下過夜。
[0155] (3)對其進(jìn)行干燥處理。
[0156] (4)用紫外線對備好的Transwell照射2h來滅菌，照射前加入少量的滅菌處理過 的無血清的MDM對其進(jìn)行水化。
[0157] (5)按照前面描述的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72h后，取U20S細(xì)胞然后按細(xì)胞數(shù) 3X104加入到每個(gè)小室中，培養(yǎng)基選用IMDM。
[0158] (6)將其放置到46孔板中培養(yǎng)。
[0159] (7)5%C02、37°C培養(yǎng)箱中孵育 24h。
[0160] (8)將小室取出后用紙巾或棉簽擦干凈上室那面的Matrigel和細(xì)胞，下室的那面 用甲醇固定l〇min后，進(jìn)行常規(guī)HE染色，用顯微鏡觀察。
[0161] (9)按照隨機(jī)選擇3個(gè)高倍鏡視野來進(jìn)行觀察，并仔細(xì)計(jì)數(shù)小室下室面的細(xì)胞個(gè) 數(shù)作為穿透Matrigel的細(xì)胞數(shù)目，這個(gè)過程進(jìn)行3次，計(jì)算其平均數(shù)來作為計(jì)算的參考依 據(jù)。
[0162] 5. 2統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0163] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計(jì)軟件來進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P < 〇.〇5時(shí)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0164] 5. 3結(jié)果
[0165] 24h后，C8orf59基因干擾組，通過Transwell膜的細(xì)胞數(shù)在顯微鏡下每個(gè)視野細(xì) 胞數(shù)的平均值為47個(gè)，而陰性對照組通過Transwell膜的細(xì)胞數(shù)在顯微鏡下每個(gè)視野細(xì)胞 數(shù)的平均值為324個(gè)，上述差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05)，表明抑制C8orf59基因的表 達(dá)，骨肉瘤細(xì)胞U20S的侵襲能力下降。
[0166]6. C8orf59基因?qū)侨饬黾?xì)胞成瘤能力的影響
[0167] 6.1 步驟：
[0168] (1)按照前面描述的方法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染72h后將U20S細(xì)胞胰酶消化后，制備 成細(xì)胞懸液；
[0169] (2)細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于6孔板中（200個(gè)細(xì)胞/孔），將接種好的細(xì)胞于培養(yǎng)箱中 繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途隔3天進(jìn)行換液并觀察 細(xì)胞狀態(tài)；實(shí)驗(yàn)終止前熒光顯微鏡下對細(xì)胞克隆進(jìn)行拍照；
[0170] (3)實(shí)驗(yàn)終止時(shí)用多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞后，Giemsa染色，拍照。
[0171] 6. 2結(jié)果
[0172] 平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，C8orf59基因表達(dá)干擾組的骨肉瘤細(xì) 胞U20S形成的克隆斑數(shù)目顯著減少、克隆斑的體積明顯減小，上述結(jié)果表明C8orf59沉默 導(dǎo)致骨肉瘤細(xì)胞形成克隆的能力下降。
[0173] 實(shí)施例5 C8orf59抗原蛋白作為骨肉瘤疫苗的應(yīng)用
[0174] 1.抗原蛋白獲得
[0175] 利用基因工程表達(dá)：可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人C8orf59基因的cDNA序列，通 過PCR擴(kuò)增獲得編碼框，根據(jù)上述序列使用多肽合成儀合成C8orf59抗原多肽。
[0176] 2. DC(樹突狀細(xì)胞）的體外分離和培養(yǎng)
[0177] 患者外周靜脈血經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液Ficoll梯度離心后分離界面單個(gè)核細(xì)胞。細(xì) 胞經(jīng)洗滌2次后，用無血清培養(yǎng)基AM-V培養(yǎng)液（GibcoBRL公司）懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度到 3X106個(gè)/ml，接種入6孔培養(yǎng)板。在37°C、5%C02孵箱中培養(yǎng)過夜后，輕輕吹打懸浮細(xì)胞 并回收凍存，用以制備效應(yīng)細(xì)胞。在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液中加入含l〇〇〇U/ml粒單集落刺激因子 和500U/ml白細(xì)胞介素的AM-V。培養(yǎng)至第7天時(shí)，收獲懸浮的DC。
[0178] 3. T2細(xì)胞或HLA-A2的EBV (Epstein Barr Virus，非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒）轉(zhuǎn)染的 人B淋巴細(xì)胞與終濃度為20 y g/ml的C8orf59抗原多肽共孵育4h，洗滌后作為靶細(xì)胞。
[0179] 4.通過以下方式鑒定本發(fā)明治療骨肉瘤的C8orf59抗原疫苗，通過DC遞呈 C8orf59抗原肽活化效應(yīng)T細(xì)胞，產(chǎn)生特異性針對C8orf59抗原表位的免疫應(yīng)答：
[0180] (1)DC細(xì)胞的處理：DC經(jīng)離心后重懸浮在2mlAM-V中，并加入C8orf59抗原肽至 該多肽終濃度為40ug/ml。37°C、5%C02培養(yǎng)18h，經(jīng)3000rad放射線照射后，洗滌待用。
[0181] (2)效應(yīng)細(xì)胞的制備：將步驟3制備的靶細(xì)胞與照射后的DC細(xì)胞以20 : 1混合 共孵育6-7天，再按照相同比例加入DC，6-7天后，再次重復(fù)刺激一次，作為效應(yīng)T細(xì)胞。于 0、7、10、14、19天，分別留取培養(yǎng)上清，用于細(xì)胞因子檢測。
[0182] (3)細(xì)胞因子檢測：采用細(xì)胞因子檢測試劑盒（購自美國Endogen公司）檢測培 養(yǎng)上清中分泌的細(xì)胞因子。
[0183] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明C8orf59抗原肽刺激的DC所活化的效應(yīng)T細(xì)胞，能產(chǎn) 生特異性針對C8orf59抗原表位的免疫應(yīng)答，從而特異性殺傷結(jié)合有該相同C8orf59抗原 肽的靶細(xì)胞，說明本發(fā)明C8orf59抗原蛋白可以作為潛在的骨肉瘤治療性疫苗。
[0184] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種診斷骨肉瘤的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品通過檢測受試者成骨細(xì)胞中 C8orf59基因的表達(dá)來判斷受試者是否患有骨肉瘤。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括：用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述用RT-PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包 括一對特異擴(kuò)增C8orf59基因的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨肉瘤的產(chǎn)品至少包括一 對特異擴(kuò)增C8orf59基因的引物；所述用免疫檢測診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與C8orf59蛋 白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位雜交診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與C8orf59基因的核酸序 列雜交的探針；所述用基因芯片診斷骨肉瘤的產(chǎn)品包括：與C8orf59基因的核酸序列雜交 的探針。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品選自以下組：試劑 盒、芯片、濾紙。 5. C8orf59基因在制備權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的診斷骨肉瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。 6. C8orf59基因在制備治療骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物選自以下組：抑制骨肉瘤細(xì)胞增 殖的藥物、抑制骨肉瘤細(xì)胞凋亡的藥物、抑制骨肉瘤細(xì)胞迀移的藥物、抑制骨肉瘤侵襲的藥 物、抑制骨肉瘤細(xì)胞成瘤的藥物。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物包括通過干擾RNA抑制C8orf 59 基因表達(dá)的雙鏈核糖核酸，或基于C8orf59抗原蛋白的腫瘤疫苗、或用于抑制C8orf59蛋白 活性的蛋白質(zhì)。
9. 一種抑制C8orf59基因表達(dá)的siRNA，其特征在于，所述siRNA序列為：正義鏈如SEQ ID NO :5所示，反義鏈如SEQ ID NO :6所示。
10. 權(quán)利要求9所述的siRNA在制備治療骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了C8orf59基因在制備診斷和治療骨肉瘤的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明C8orf59基因在骨肉瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，因此，C8orf59基因可作為診斷骨肉瘤的特異性標(biāo)志物，使骨肉瘤診斷更加準(zhǔn)確、快速。本發(fā)明通過干擾骨肉瘤細(xì)胞系中C8orf59基因的表達(dá)可以明顯抑制細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、成瘤能力，同時(shí)加速細(xì)胞凋亡。因此C8orf59基因?qū)侨饬龅幕蛑委熅哂袧撛诘膽?yīng)用價(jià)值，有望將其應(yīng)用于骨肉瘤的治療，并在此基礎(chǔ)上，開發(fā)抗骨肉瘤的新藥，為臨床骨肉瘤的防治做出貢獻(xiàn)。
【IPC分類】A61K48-00, G01N33-68, A61K31-7088, A61P35-00, C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104651509
【申請?zhí)枴緾N201510075920
【發(fā)明人】楊承剛, 孫耀蘭, 邊洋
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2015年2月13日