高效非整合性人類iPSC誘導(dǎo)平臺的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種將人類體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的誘導(dǎo)劑、誘導(dǎo)方法及誘導(dǎo)培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]iPSC的成功誘導(dǎo)是干細(xì)胞研究的一個重大突破，iPSC解決了人ESC研究中存在的倫理學(xué)等問題，避開了核移植技術(shù)缺乏人卵母細(xì)胞的難題，為干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)的臨床應(yīng)用提供新的種子細(xì)胞來源；同時，也為發(fā)育生物學(xué)、疾病發(fā)生發(fā)展機制、基因與蛋白質(zhì)功能研究以及藥物篩選等提供重要的研究平臺。
[0003]現(xiàn)有將體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC方法有多種，如基因敲除、整合外源基因、細(xì)胞因子誘導(dǎo)或其結(jié)合?；蚯贸⒃诨蚪M中整合外源基因會改變基因組，導(dǎo)致得到的iPSC不夠穩(wěn)定，存在極大的癌變可能，這些風(fēng)險的存在阻礙了其應(yīng)用。
[0004]2007 年日本、美國的科學(xué)家(Takahashi et al.2007 ；Yu et al.2007 ；Parket al.2008)相繼報道，在人類體細(xì)胞中通過逆轉(zhuǎn)錄病毒(或慢病毒)過表達四個轉(zhuǎn)錄因子基因(0ct4, Sox2, Klf4與c-Myc,或者0ct4, Sox2, Nanog與Lin28),逆轉(zhuǎn)人類成體細(xì)胞的分化狀態(tài)，獲得多能潛能干細(xì)胞(iPSC, induced pluripotent stem cell)。有報道證實，通過病毒載體導(dǎo)入0ct3/4和Sox2兩種轉(zhuǎn)錄因子基因，即可將體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞(Danwei Huangfu, 2008)。2009 年 3 月 5 日，Cell 報道Rudolf Jaenisch 研究組利用Cre-重組酶系統(tǒng)使誘導(dǎo)成功的帕金森病人iPSC無外源因子，使iPSC臨床應(yīng)用又推進了一步。2009年3月26日，Science報道俞君英等通過一種非整合質(zhì)粒Episomal Vector成功誘導(dǎo)出無外源基因也無載體整合到基因組上的iPSC (俞君英等人，無載體也無外源基因序列的人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，科學(xué)，2009.324:7797-801)。人類體細(xì)胞重編程為多潛能干細(xì)胞(iPSC)是近兩年來干細(xì)胞研究領(lǐng)域的重要里程碑事件。在2007-2008年連續(xù)兩年被science雜志評為十大科學(xué)進展(Kennedy 2007 ；Vogel 2008)。多種研究表明，通過引入利于iPSC誘導(dǎo)的外源基因，有助于將體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC。特別的，使用附加型(非整合型)載體轉(zhuǎn)染外源基因，可以有效避免外源基因整合到基因組中，安全性有所提高，日益受到人們的重視。
[0005]純化學(xué)試劑誘導(dǎo)iPSC完全避免了引入外源基因，具有更高的安全性，日益成為iPSC研究中的熱點。小鼠體細(xì)胞是進行iPSC誘導(dǎo)研究時常用的對象，人們從其中獲得了大量的研究數(shù)據(jù)。Ying et al，2008指出，包含糖原合酶激酶和絲裂原活化蛋白激酶信號抑制劑的(2i)培養(yǎng)基可以維持小鼠ES細(xì)胞處于基態(tài)。2013年7月18日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鄧宏魁教授和趙揚博士帶領(lǐng)的研究團隊在《Science》雜志上發(fā)表了題為“PluripotentStem Cells Induced from Mouse Somatic Cells by Small-Molecule Compounds，，的文章。文章中他們僅使用4個小分子化合物的組合對體細(xì)胞進行處理，成功逆轉(zhuǎn)其“發(fā)育時鐘”，重新賦予體細(xì)胞“多潛能性”，為誘導(dǎo)體細(xì)胞成為多能性干細(xì)胞提供了更加簡單和安全的方法。此項工作之前，該研究小組報道了一種將多種小分子化合物“VC6T” [VPA,CHIR99021 (CHIR)，616452，Tranylcypromine]聯(lián)合0ct4單個外源基因?qū)雽崿F(xiàn)小鼠體細(xì)胞重編程的方法。通過在小鼠成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts , MEFs)中轉(zhuǎn)入由0CT4啟動子啟動GFP表達的質(zhì)粒系統(tǒng)(0ct4 promoter-driven GFP express1n ,0G)，利用啟動GFP表達對10000多種化學(xué)小分子進行篩選，選出了 For-skolin (FSK)等0CT4“替代物”。隨后，研究人員對多種化合物組合進行優(yōu)化，并通過添加DZN印，一種已知可促成晚期重編程階段的化合物，得到了完全重編程的細(xì)胞，并最終利用7個化合物組合的混合物，將重編程效率提高至0.2%，與目前常用的建立小鼠iPS細(xì)胞的技術(shù)相當(dāng)。
[0006]由于遺傳背景和培養(yǎng)條件差異過大，我們和別人的研究表明適用于小鼠的iPSC誘導(dǎo)條件根本無法應(yīng)用于人iPSC的誘導(dǎo)，還沒有化學(xué)誘導(dǎo)人類iPS細(xì)胞的成功報道。目前發(fā)展的游離體載體等誘導(dǎo)方法用于人類iPSC的誘導(dǎo)也能成功，并且比較安全，但是與小鼠的iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率更低，只有0.1?1%。開發(fā)出高效安全的將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的技術(shù)具有非常實際的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種可以將人體細(xì)胞高效誘導(dǎo)為iPSC的組合物及培養(yǎng)方法。
[0008]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
用于將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的組合物，由前誘導(dǎo)劑和后誘導(dǎo)劑組成，其中，
前誘導(dǎo)劑的活性成分為:轉(zhuǎn)化生長因子β抑制劑、糖原合成酶激酶3抑制劑、CAMP激動劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑和p21活化激酶抑制劑；
后誘導(dǎo)劑的活性成分為:糖原合成酶激酶3抑制劑、選擇性ATP非競爭性的MEK抑制劑和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑。
[0009]作為本發(fā)明的進一步改進，上述前誘導(dǎo)劑和后誘導(dǎo)劑中，轉(zhuǎn)化生長因子β抑制劑選自 E-616452、SB431542、LDN193189、Dorsomorphin, LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、D4476、IDEl、ITDl、SD208、A83-01。
[0010]作為本發(fā)明的進一步改進，上述組合物中，糖原合成酶激酶3抑制劑選自CHIR-99021、TWS119、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、SB415286、LY2090314、AZD1080、3F8、L308、NSC693868、Kenpaulone, TCG24、TCS2002、FRATide, Indirubin-3’ -oxime、ARA-A014418、B10、MeB1。
[0011]作為本發(fā)明的進一步改進，上述組合物中，CAMP激動劑選自Forskolin、NKH477。
[0012]作為本發(fā)明的進一步改進，上述組合物中，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑選自 DZN印、UNC0224、UNC0642、UNC0646、UNC0638、SGC0946、PFI2、C21、TC-E5003、Chaetocin、BIX01294。
[0013]作為本發(fā)明的進一步改進，上述組合物中，p21活化激酶抑制劑選自IPA-3、FRAX486。
[0014]作為本發(fā)明的進一步改進，上述組合物中，選擇性ATP非競爭性的MEK抑制劑選自PD0325901、10Z-Hymenialdisine、PD184352、PD198306、PD334581、SL327、U0126。
[0015]一種將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的方法，包括如下步驟:
I)將人體細(xì)胞置于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液中，加入附加型載體及至少一種有利于iPSC誘導(dǎo)的外源基因進行轉(zhuǎn)染培養(yǎng)； 2)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)，之后加入ESC培養(yǎng)液中，添加前誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到前誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞；
3)將前誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞置于添加有后誘導(dǎo)劑的ESC培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)得到iPSC；
前誘導(dǎo)劑和后誘導(dǎo)劑的組成如上所述。
[0016]作為上述將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC方法的進一步改進，有利于iPSC誘導(dǎo)的外源基因選自 0CT3/4、p53 shRNA、S0X2、KLF4、L-MYC、LIN28、Nanog。
[0017]一種將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的培養(yǎng)基，由前誘導(dǎo)培養(yǎng)基和后誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成，前誘導(dǎo)培養(yǎng)基中上述的前誘導(dǎo)劑，后誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加有上述的后誘導(dǎo)劑。
[0018]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明的誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)效率高，iPSC的前誘導(dǎo)效率達6.4%。通過后誘導(dǎo)培養(yǎng)，可以將前誘導(dǎo)物進一步誘導(dǎo)為iPSC，誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)，有利于iPSC的分離和純化。
[0019]本發(fā)明的誘導(dǎo)方法，不會在基因組中引入外源基因，得到的iPSC成熟度高，細(xì)胞形態(tài)、性能更接近于ESC，最終得到的iPSC中無外源基因插入，細(xì)胞的遺傳背景與原有的體細(xì)胞保持一致，具有極高的應(yīng)用價值。同時，誘導(dǎo)得到的iPSC具有很好的穩(wěn)定性。
【附圖說明】
[0020]圖1是前誘導(dǎo)培養(yǎng)24 D后不同組細(xì)胞的ALP染色結(jié)果；
圖2是前誘導(dǎo)培養(yǎng)24 D后不同組細(xì)胞的SSEA4免疫染色和流式細(xì)胞分析結(jié)果；
圖3是不同處理組誘導(dǎo)得到的細(xì)胞中ESC的標(biāo)記物SSEA4的表達情況分析；
圖4是誘導(dǎo)得到的成熟iPSC細(xì)胞的iPSC特異性抗體染色結(jié)果，紅色為Oct-4，綠色為Tra-1-60 ；
圖5是不同處理組誘導(dǎo)得到的細(xì)胞中ESC的標(biāo)記物0ct4、Nanog和Sox2的表達情況分析；
圖6是不同細(xì)胞集落的外源基因整合情況分析；
圖7是誘導(dǎo)得到的iPSCs的畸胎瘤實驗結(jié)果；
圖8是誘導(dǎo)前后的成纖維細(xì)胞的形態(tài)照片。
【具體實施方式】
[0021]用于將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的組合物，由前誘導(dǎo)劑和后誘導(dǎo)劑組成，其中，
前誘導(dǎo)劑的活性成分為:轉(zhuǎn)化生長因子β抑制劑、糖原合成酶激酶3抑制劑、cAMP激動劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑和p21活化激酶抑制劑；
后誘導(dǎo)劑的活性成分為:糖原合成酶激酶3抑制劑、選擇性ATP非競爭性的