MEK抑制劑和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑。
[0022]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述前誘導(dǎo)劑和后誘導(dǎo)劑中，轉(zhuǎn)化生長因子β抑制劑選自 E-616452、SB431542、LDN193189、Dorsomorphin, LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、D4476、IDEl、ITDl、SD208、A83-01。
[0023]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述組合物中，糖原合成酶激酶3抑制劑選自CHIR-99021、TWS119、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、SB415286、LY2090314、AZD1080、3F8、L308、NSC693868、Kenpaulone, TCG24、TCS2002、FRATide, Indirubin-3’ -oxime、ARA-A014418、B10、MeB1。
[0024]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述組合物中，cAMP激動(dòng)劑選自Forskolin、NKH477。
[0025]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述組合物中，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑選自 DZN印、UNC0224、UNC0642、UNC0646、UNC0638、SGC0946、PFI2、C21、TC-E5003、Chaetocin、BIX01294。
[0026]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述組合物中，p21活化激酶抑制劑選自IPA-3、FRAX486。
[0027]特別的，前誘導(dǎo)劑的活性成分為:10μΜ的616452、10μΜ的Chir99021、20 μ M的Forskolin、50ηΜ的DZN印和I?50uM的p21活化激酶抑制劑III ;后誘導(dǎo)劑的活性成分為:IuM PD0325901、10uM CHIR099021、50nM DZNep。
[0028]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，上述組合物中，選擇性ATP非競爭性的MEK抑制劑選自PD0325901、10Z-Hymenialdisine、PD184352、PD198306、PD334581、SL327、U0126。
[0029]因?yàn)楦鞣N化合物的活性不一，無法統(tǒng)一定義其用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以參考相關(guān)的小分子抑制劑文獻(xiàn)報(bào)道等確定其最低用量和最高用量，使用這些小分子化合物的濃度等一系列數(shù)據(jù)已有完整的相關(guān)報(bào)道，此外下述的文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)方案可為本發(fā)明的參考之一。
[0030]轉(zhuǎn)化生長因子β抑制劑、糖原合成酶激酶3抑制劑、cAMP激動(dòng)劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑這一組合是已經(jīng)被廣泛研究的小鼠CiPSC誘導(dǎo)劑，具體可參見HouP.,Li Y., Zhang X.，Liu C.，Guan J.，Li H.Zhao T.,Ye J.，Yang ff.，Liu K.,Ge J.，XuJ., Zhang Q., Zhao Y., & Deng H.,2013, Pluripotent stem cells induced from mousesomatic cells by small-molecule compounds, Science, 341 (2013): 651-654。
[0031]P21活化激酶抑制劑，如IPA-3可以參考文獻(xiàn)(Deacon，S.ff.et al.Anisoform-selective, small-molecule inhibitor targets the autoregulatorymechanism of p21_activated kinase.Chemistry & b1logy 15, 322-331X 前誘導(dǎo)劑的活性成分為:轉(zhuǎn)化生長因子β抑制劑、糖原合成酶激酶3抑制劑、cAMP激動(dòng)劑、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑和Ρ21活化激酶抑制劑。在前誘導(dǎo)劑組合物作用下，iPSC的前誘導(dǎo)效率達(dá)6.4%。
[0032]已有研究證實(shí)，添加有21 (含糖原合酶激酶抑制劑和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)抑制劑)的ESC培養(yǎng)液，可以保持小鼠ESC維持基態(tài)(Ying QL，Wray J, Nichols J，Batlle-Morera L, Doble B, Woodgett J, Cohen P, Smith A.,2008, The ground stateof embryonic stemcell self-renewal.Nature; 453(7194): 519-23),同時(shí)有助于小鼠iPSC進(jìn)一步轉(zhuǎn)化至更為接近ESC。但是將21用于人的iPSC誘導(dǎo)中，并不能促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步重編程轉(zhuǎn)化為接近ESC的人類iPSC。
[0033]發(fā)明人在21的基礎(chǔ)上，篩選添加另外一個(gè)已知效果小分子化合物S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑(具體可參見Hou等，2013)，組成后誘導(dǎo)劑組合。完整的后誘導(dǎo)劑的活性成分為:糖原合成酶激酶3抑制劑、選擇性ATP非競爭性的MEK抑制劑和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制劑。將前誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞置于添加有后誘導(dǎo)劑的ESC培養(yǎng)液中，可以提高誘導(dǎo)效率，將全誘導(dǎo)物可以提高效率至20.8%，也可以將前誘導(dǎo)物克隆全部進(jìn)一步重編程轉(zhuǎn)化為接近ESC的人類iPSC克隆。誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)，有利于iPSC的分離和純化。
[0034]一種將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的方法，包括如下步驟: 1)將人體細(xì)胞置于轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液中，加入附加型載體及至少一種有利于iPSC誘導(dǎo)的外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染；
2)將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)，之后加入ESC培養(yǎng)液中，添加前誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，得到前誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞；
3)將前誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞置于添加有后誘導(dǎo)劑的ESC培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)得到iPSC；
前誘導(dǎo)劑和后誘導(dǎo)劑的組成如上所述。
[0035]附加型載體的作用在于不改變?cè)蚪M的情況下，將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。外源基因的轉(zhuǎn)染操作可以按已有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的方法進(jìn)行。附加型載體可以是現(xiàn)有公知的附加型載體。
[0036]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有利于iPSC誘導(dǎo)的外源基因有多種，其中0CT3/4、p53 shRNA、S0X2、KLF4、L-MYC、LIN28 又稱 Y4 因子(Okita K.，Nakagawa Μ.，Hyenjong H.，Ichisaka Τ.，& Yamanaka S.,2008, Generat1n of mouse induced pluripotent stem cells withoutviral vectors, Science, 322: 949-953),其功能也已被深入研究，已有研究表明Y4可以將小鼠體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC。
[0037]作為上述將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC方法的進(jìn)一步改進(jìn)，有利于iPSC誘導(dǎo)的外源基因選自 0CT3/4、p53 shRNA、S0X2、KLF4、L-MYC、LIN28、Nanog。
[0038]一種將人體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPSC的培養(yǎng)基，由前誘導(dǎo)培養(yǎng)基和后誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成，前誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加有上述的前誘導(dǎo)劑，后誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加有上述的后誘導(dǎo)劑。添加前誘導(dǎo)劑或后誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基可以是公知的hESC培養(yǎng)基，或其他類似的干細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0039]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0040]患者成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)
從患者的皮膚取直徑約為2_的樣品，取樣在廣東省中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會(huì)的指導(dǎo)和批準(zhǔn)之下進(jìn)行并獲得患者的書面同意。將樣品進(jìn)行消毒、滅菌處理，之后切成4塊培養(yǎng)在容納在T25培養(yǎng)瓶中的MEF培養(yǎng)液中((DMEM 11965,450ml; Glutamax, 5 mL，熱失活處理的FBS(Hyclone), 50mL,添加有IX青霉素/鏈霉素的β_巰基乙醇(1000 X , ImL)),培養(yǎng)液每周更換一次。
[0041]當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)至80?90%滿時(shí)，用胰蛋白酶消化，按1:3的比例繼代培養(yǎng)。起始培養(yǎng)一般約需要I個(gè)月或更長的時(shí)間。之后，繼代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)分裂可每周進(jìn)行一次。
[0042]附加型載體及外源基因組合
附加型載體源自Yamanaka實(shí)驗(yàn)室,購自Addgene,詳情如下:Υ4載體組合由3種載體組合，pCXLE-h0CT3/4-shp53攜帶有外源基因0CT3/4，p53 shRNA ;pCXLE_hSK攜帶有外源基因S0X2，KLF4 ；pCXLE-hUL攜帶有外源基因L-MYC，LIN28。使用GFP載體監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)染效率。
[0043]使用附加型載體轉(zhuǎn)染人成纖維細(xì)胞
使用Lonza-4D的核轉(zhuǎn)染儀進(jìn)行轉(zhuǎn)染,試劑盒為推薦的試劑盒(4D_Nucleotector XKit, Cat.N0.V4XP-2024)，細(xì)胞為2?5代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)按推薦的方法進(jìn)行，確定添加的外源基因DNA及其他條件如下:
外源基因包括0ct4/hsP53，hSK，hUL，總DNA量為2 μ g/轉(zhuǎn)染回到核轉(zhuǎn)染儀工作液中，核轉(zhuǎn)染儀工作液與外源基因的比例為4.5:1，每轉(zhuǎn)染的Nucleocuvette工作液的總體積為100 μ L。
[0044]iPSC 的誘導(dǎo)
1)轉(zhuǎn)染后的人成纖維細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)2天，培養(yǎng)液使用胰蛋白酶消化，之后均分到覆蓋有人工基底膜的6孔板，細(xì)胞密度為3 X 14個(gè)/孔，細(xì)胞培養(yǎng)液為添加有bFGF的ESC培養(yǎng)液；對(duì)照組未添加小分子組合物；化合物處理組添加有4M或4M+9。4M分別為10 μ M的616452、10 μ M Chir99021、20 μ M 的 Forskolin 和 50ηΜ 的 DZN印，4Μ+9 為在 4Μ 的基礎(chǔ)上額外添加I?50uM的p21活化激酶抑制劑III IPA-3 ；
2)培養(yǎng)4天后，在對(duì)照組的孔內(nèi)添加等量的0.4ml新鮮hESC培養(yǎng)液，在處理組的孔內(nèi)添加 0.4ml 添加有 PCZ (PD0325901 luM、CHIR099021 1uM ,DZNep 50nM)的