的生產(chǎn)工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，通過(guò)添加表面活性劑改變細(xì)胞膜通透性，解除胞內(nèi)產(chǎn)物的反饋抑制，有效提高黃桿菌產(chǎn)維生素K2發(fā)酵能力。
【背景技術(shù)】
[0002]維生素K又稱抗出血維生素，是具有葉綠醌生物活性的α -甲基-1，4-萘醌衍生物的總稱，體內(nèi)包括維生素&和維生素K 2。維生素Κ2(簡(jiǎn)寫(xiě)為ΜΚ-η)為系列化合物，統(tǒng)稱為甲基萘醌類，其側(cè)鏈有一不飽和的多異戊二烯基，根據(jù)側(cè)鏈長(zhǎng)短的不同有多種形式，最常見(jiàn)的是側(cè)鏈上有4?10個(gè)類異戊二烯基的甲基萘醌(從ΜΚ-4到ΜΚ-10)。維生素K2具有多種生理功能，如維生素K2可促進(jìn)凝血酶原的形成，維持機(jī)體的正常凝血，可以通過(guò)促進(jìn)谷氨酸殘基羧化成γ -羧化谷氨酸殘基促進(jìn)骨骼形成，還具有利尿、強(qiáng)化肝臟的解毒功能，預(yù)防肝硬化發(fā)展為肝癌等多種生理功能。神經(jīng)科學(xué)家Patrik Verstreken研宄小組發(fā)現(xiàn)維生素K2能恢復(fù)導(dǎo)致帕金森氏癥的一個(gè)遺傳缺陷的影響，為帕金森氏患者帶來(lái)新希望。帕金森疾病中pinkl基因突變會(huì)影響線粒體功能，果幡中的UBIADl/Heix是pinkl的調(diào)節(jié)基因，維生素K2能恢復(fù)Heix突變引起的嚴(yán)重線粒體缺陷。表明維生素K 2在醫(yī)藥工業(yè)上有進(jìn)一步的應(yīng)用潛力。
[0003]黃桿菌屬革蘭氏陰性菌，能夠發(fā)酵生產(chǎn)維生素K2，主要合成ΜΚ-4和ΜΚ-6，其維生素1(2的合成主要發(fā)生在胞內(nèi)，而胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物的合成量往往受到不斷累積的產(chǎn)物的反饋抑制，如果在不影響菌體生長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，能使胞內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)物不斷溢出到胞外可避免反饋抑制，控制代謝流流向目標(biāo)產(chǎn)物，對(duì)于提高黃桿菌胞內(nèi)胞外維生素K2的總產(chǎn)量具有重要意義。
[0004]表面活性劑由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征，具有增加細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的作用，可使代謝產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，消除代謝產(chǎn)物的負(fù)反饋?zhàn)饔?，使產(chǎn)物在發(fā)酵液中積累，最終達(dá)到了提高產(chǎn)率的目的。目前，表面活性劑作為發(fā)酵促進(jìn)劑主要致力于誘發(fā)谷氨酸分泌的機(jī)理方面的研宄。滲漏模型(leak model)是普遍接受的機(jī)制。1968年，Takinami等根據(jù)生物素和脂肪酸與谷氨酸積累的相互關(guān)系的研宄結(jié)果認(rèn)為，生物素的缺乏降低了脂肪酸合成酶活性，引起磷脂含量的減少并改變磷脂和脂肪酸的組成，導(dǎo)致磷脂雙分子層物理性質(zhì)的改變，對(duì)谷氨酸具有可透性，引起谷氨酸被動(dòng)擴(kuò)散的溢出降低了胞內(nèi)濃度，使胞內(nèi)谷氨酸濃度控制在某一規(guī)定水平下而解除谷氨酸的反饋抑制，于是菌體細(xì)胞繼續(xù)合成谷氨酸并分泌出去。Huchenq等發(fā)現(xiàn)表面活性劑抑制了細(xì)胞膜脂肪酸的合成，從而改變了細(xì)胞膜的組成成分，改變其通透性，使產(chǎn)生的谷氨酸能更好的滲透到細(xì)胞外。Duperray等通過(guò)加入兩種季錢(qián)鹽表面活性劑(DA、DTA)，研宄谷氨酸分泌到細(xì)胞外的誘發(fā)機(jī)制，結(jié)果表明季銨鹽類表面活性劑可以有效提高谷氨酸的分泌量。非離子表面活性劑毒性較小，幾乎不影響菌體的生長(zhǎng)，在保證生物量不變的前提下，非離子表面活性劑對(duì)促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞吸收，提高維生素1(2的產(chǎn)量具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，包括如下步驟:
[0007](I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12_24h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20-30g/L、牛肉膏10-20g/、L、K2HP044_5g/L、NaCl3-4g/L、MgSO4.7H20 0.3-0.5g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的 pH 為 7.0 ;
[0008](2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟(I)的一級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按3-8%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-36h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖10-20g/L、酵母浸膏5_15g/L、K2HP042-4g/L、NaCl 2_3g/L、MgSO4.7H20 0.2-0.4g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的 pH 為 7.0 ;
[0009](3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟⑵中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按5-10%接種量接種于500ml搖瓶或3.7L-30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)8_48h后，添加0.005-5 %表面活性劑繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)120-200h ；
[0010](4)、胞內(nèi)提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定；
[0011](5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定。
[0012]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，步驟(3)中加入的表面活性劑選自陽(yáng)離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑和兩性離子型表面活性劑中的一種或幾種。
[0013]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述陽(yáng)離子型表面活性劑選自脫氫樅胺(DA)、十二烷基三甲基溴化銨(DTA)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或三乙醇胺(TEA)。
[0014]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述陰離子型表面活性劑選自十二烷基硫酸鈉、月桂醇硫酸鈉、十二烷基苯磺或十二烷基硫酸銨。
[0015]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述非離子型表面活性劑選自Tween-60、Tween-80、APG,TtitonX-100 或 OP-1O0
[0016]作為上述方案的進(jìn)一步優(yōu)化，所述兩性離子型表面活性劑選自烷基二甲基甜菜堿、烷基二甲基磺乙基甜菜堿、烷基二甲基羥丙基磷酸脂甜菜堿或十二烷基氨基丙酸。
[0017]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝通過(guò)添加不同種類、濃度的表面活性劑，一方面提高黃桿菌細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的釋放，解除胞內(nèi)代謝物對(duì)其自身合成的反饋抑制，提高維生素K2的產(chǎn)量；另一方面有利于產(chǎn)物的分離純化和連續(xù)生產(chǎn)，提高生產(chǎn)效率，降低成本，為維生素K2的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素1(2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例一的胞內(nèi)維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0019]圖2為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素1(2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例一的胞外維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0020]圖3為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例二胞內(nèi)維生素K 2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0021]圖4為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例二胞外維生素K 2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0022]圖5為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例三胞內(nèi)維生素K 2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0023]圖6為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例三胞外維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0024]圖7為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例四胞內(nèi)維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0025]圖8為本發(fā)明一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝的實(shí)施例四胞外維生素K 2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0027]實(shí)施例一
[0028]本實(shí)施例以黃桿菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作為出發(fā)菌株，包括以下步驟:
[0029](I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20g/L、牛肉膏10g/L、K2HP044g/L，NaCl 3g/L、MgSO4.7H200.3g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0030](2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟⑴的一級(jí)種子培養(yǎng)液，按3%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖10g/L、酵母浸膏5g/L、K2HP042g/L、NaCl2g/L、MgSO4.7H20 0.2g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0031](3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟⑵中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按5%接種量接種于500ml搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)20h后，添加Tri tonX-100為0.05%，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)36h后，加入十二烷基硫酸鈉為0.1 %，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)120h提取發(fā)酵產(chǎn)物；
[0032](4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定；參見(jiàn)圖1，為本實(shí)施例的胞內(nèi)維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0033](5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定，參見(jiàn)圖2，為本實(shí)施例的胞外維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0034]通過(guò)本實(shí)施例的工藝步驟制備的維生素K2總產(chǎn)量提高了 150%。
[0035]實(shí)施例二
[0036]本實(shí)施例以黃桿菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作為出發(fā)菌株，包括以下步驟:
[0037](I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖25g/L、牛肉膏10g/L、K2HP045g/L，NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.4g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0038](2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟⑴的一級(jí)種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20g/L、酵母浸膏5g/L、K2HP042g/L、NaCl2g/L、MgSO4.7H200.4g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0039](3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟⑵中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按10%接種量接種于500ml搖瓶，發(fā)酵培養(yǎng)1h后，添加0P-10為0.005%，發(fā)酵30h后，加入CTAB為2%，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)180h提取發(fā)酵產(chǎn)物；
[0040](4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定；參見(jiàn)圖3，為本實(shí)施例的胞內(nèi)維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0041](5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定，參見(jiàn)圖4，為本實(shí)施例的胞外維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0042]與傳統(tǒng)工藝相比，通過(guò)本實(shí)施例的工藝步驟制備的維生素K2總產(chǎn)量提高了 200%。
[0043]實(shí)施例三
[0044]本實(shí)施例以黃桿菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作為出發(fā)菌株，包括以下步驟:
[0045](I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖30g/L、牛肉膏10g/L、K2HP045g/L，NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.4g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0046](2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟(I)的一級(jí)