種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20g/L、酵母浸膏5g/L、K2HP042g/L、NaCl2g/L、MgSO4.7H200.4g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0047](3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟⑵中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按10%接種量接種于30L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)24h后，添加TritonX-1O為0.1 %，發(fā)酵30h后，加入Tween-80為I %，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)200h提取發(fā)酵產(chǎn)物；
[0048](4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定；參見(jiàn)圖5，為本實(shí)施例的胞內(nèi)維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0049](5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定，參見(jiàn)圖6，為本實(shí)施例的胞外維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0050]與傳統(tǒng)工藝相比，通過(guò)本實(shí)施例的工藝步驟制備的維生素K2總產(chǎn)量提高了 280%。
[0051]實(shí)施例四
[0052]本實(shí)施例以黃桿菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作為出發(fā)菌株，包括以下步驟:
[0053](I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖25g/L、牛肉膏15g/L、K2HP045g/L，NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.5g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0054](2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟(I)的一級(jí)種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20g/L、酵母浸膏15g/L、K2HP044g/L、NaCl 3g/L、MgSO4.7H200.4g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的 pH 為 7.0 ;
[0055](3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟⑵中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按5%接種量接種于5L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)12h后，添加烷基二甲基甜菜堿為0.005%，發(fā)酵24h后，加入十二烷基硫酸銨為0.02%，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)180h提取發(fā)酵產(chǎn)物；
[0056](4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定；參見(jiàn)圖7，為本實(shí)施例的胞內(nèi)維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0057](5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定，參見(jiàn)圖8，為本實(shí)施例的胞外維生素K2產(chǎn)量的HPLC檢測(cè)圖。
[0058]與傳統(tǒng)工藝相比，通過(guò)本實(shí)施例的工藝步驟制備的維生素K2總產(chǎn)量提高了 230%。
[0059]實(shí)施例五
[0060]本實(shí)施例以黃桿菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作為出發(fā)菌株，包括以下步驟:
[0061](I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖25g/L、牛肉膏15g/L、K2HP045g/L，NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.5g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0062](2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟(I)的一級(jí)種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20g/L、酵母浸膏15g/L、K2HP045g/L、NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.5g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的 pH 為 7.0 ;
[0063](3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟(2)中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按5%接種量接種于5L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)12h后，添加烷基二甲基甜菜堿為0.005%，發(fā)酵24h后，加入十二烷基硫酸銨為0.02 %，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)200h提取發(fā)酵產(chǎn)物；
[0064](4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定。
[0065](5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定。
[0066]與傳統(tǒng)工藝相比，通過(guò)本實(shí)施例的工藝步驟制備的維生素K2總產(chǎn)量提高了 210%。
[0067]實(shí)施例六
[0068]本實(shí)施例以黃桿菌(Elizabethkingiameningoseptica CCTCC AB2010137)作為出發(fā)菌株，包括以下步驟:
[0069](I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20g/L、牛肉膏10g/L、K2HP044g/L，NaCl 3g/L、MgSO4.7H200.3g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ;
[0070](2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟(I)的一級(jí)種子培養(yǎng)液，按3%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖10g/L、酵母浸膏10g/L、K2HP042g/L、NaCl 32g/L、MgSO4.7H200.2g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的 pH 為 7.0 ;
[0071](3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟⑵中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按5%接種量接種于5L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)18h后，添加Tween-60為0.2 %，發(fā)酵24h后，加入月桂醇硫酸鈉為0.1 %，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)150h提取發(fā)酵產(chǎn)物；
[0072](4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定。
[0073](5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定。與傳統(tǒng)工藝相比，通過(guò)本實(shí)施例的工藝步驟制備的維生素K2總產(chǎn)量提高了 180%。
[0074]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括如下步驟: (1)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12-24h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20-30g/L、牛肉膏10-20g/、L、K2HPO4 4_5g/L、NaCl 3_4g/L、MgSO4.7H20 0.3-0.5g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ; (2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟(I)的一級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按3-8%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-36h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖10-20g/L、酵母浸膏5_15g/L、K2HP042-4g/L、NaCl 2_3g/L、MgSO4.7H20 0.2-0.4g/L、且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的 pH 為 7.0 ; (3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟(2)中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按5-10%接種量接種于500ml搖瓶或3.7L-30L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)8-48h后，添加0.005-5 %表面活性劑繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)120-200h ； (4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定； (5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以10000r/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，其特征在于， 步驟(3)中加入的表面活性劑選自陽(yáng)離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑、非離子型表面活性劑和兩性離子型表面活性劑中的一種或幾種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，其特征在于，所述陽(yáng)離子型表面活性劑選自脫氫樅胺(DA)、十二烷基三甲基溴化銨(DTA)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)或三乙醇胺(TEA)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，其特征在于:所述陰尚子型表面活性劑選自十一燒基硫酸納、月桂醇硫酸納、十一燒基苯橫或十一燒基硫酸銨。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，其特征在于:所述非離子型表面活性劑選自 Tween-60、Tween-80、APG、TtitonX-1OO 或 OP-1O0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，其特征在于:所述兩性離子型表面活性劑選自烷基二甲基甜菜堿、烷基二甲基磺乙基甜菜堿、烷基二甲基羥丙基磷酸脂甜菜堿或十二烷基氨基丙酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝，其特征在于，包括如下步驟:(I)、一級(jí)培養(yǎng):取黃桿菌試管斜面一環(huán)，接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該一級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖30g/L、牛肉膏10g/L、K2HPO4 5g/L、NaCl 4g/L、MgSO4.7H200.4g/L，且該一級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ; (2)、二級(jí)培養(yǎng):取步驟(I)的一級(jí)種子培養(yǎng)液，按5%接種量接種于二級(jí)種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，該二級(jí)種子培養(yǎng)基的組成為:麥芽糖20g/L、酵母浸膏5g/L、K2HPO4 2g/L、NaCl2g/L、MgSO4.7H200.4g/L，且該二級(jí)種子培養(yǎng)基的pH為7.0 ; (3)、發(fā)酵培養(yǎng):取步驟(2)中的二級(jí)種子瓶培養(yǎng)液，按10%接種量接種于30L發(fā)酵罐，發(fā)酵培養(yǎng)24h后，添加TritonX-1O為0.1 %，發(fā)酵30h后，加入Tween-80為I %，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)200h提取發(fā)酵產(chǎn)物； (4)、胞內(nèi)產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液離心棄上清，菌體真空冷凍干燥后，加入甲醇萃取，采用高效液相色譜法分析測(cè)定； (5)、胞外產(chǎn)物提取:將步驟(3)得到的發(fā)酵液以15000r/min離心旋轉(zhuǎn)lOmin，取上清，加入同等體積的正丁醇，漩禍震蕩lOmin，混勾后再以lOOOOr/min離心旋轉(zhuǎn)5min，取上層有機(jī)相采用高效液相色譜法分析測(cè)定。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝,在發(fā)酵培養(yǎng)液中接入二級(jí)種子培養(yǎng)液，同時(shí)向發(fā)酵液中添加一定濃度的表面活性劑，促使維生素K2從胞內(nèi)滲漏到胞外，解除胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的抑制作用。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的一種基于黃桿菌產(chǎn)維生素K2的生產(chǎn)工藝使維生素K2的發(fā)酵單位提高了200-260％，為維生素K2的大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵提供一種可行的發(fā)酵策略。
【IPC分類】C12R1-01, C12P7-66
【公開(kāi)號(hào)】CN104673849
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510137112
【發(fā)明人】鄭之明, 方雪, 趙根海, 劉會(huì), 王鵬, 王麗, 王晗, 檀沐, 尉鴻飛, 孫小雯, 李哲敏, 吳荷芳, 劉紅霞, 孫孝娟
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院
【公開(kāi)日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月26日