用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物SSIV-1b及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物SSIV-lb及其檢 測方法，屬于植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 作為能量和碳素的重要儲存方式，植物中淀粉的合成是分別在造粉體和葉綠體中 完成的。其中造粉體合成儲藏型淀粉，這些淀粉主要儲藏在植物的種子、塊莖、根等組織中， 是食用或工業(yè)用淀粉的主要來源；葉綠體則合成過渡淀粉，而過渡淀粉是調(diào)控植物生長發(fā) 育的重要因素。白天或光照條件下，植物經(jīng)光合作用固定二氧化碳合成糖類，并經(jīng)過一系列 的催化反應(yīng)最終合成過渡淀粉；夜晚或黑暗條件下，植物通過降解過渡淀粉以提供其生長 所必需的碳素。在不同的光照/黑暗條件下，植物通過調(diào)節(jié)過渡淀粉合成/降解的速率實 現(xiàn)其正常的生長發(fā)育（Bahaji et al. 2014)。因此過渡淀粉的合成/降解對植物的生長速 度及生物產(chǎn)量的形成起著重要的作用。
[0003] 儲藏淀粉和過渡淀粉均以淀粉粒的形式存在于植物體中，而淀粉粒是由直鏈和支 鏈淀粉組成的。直鏈淀粉和支鏈淀粉均以ADP葡萄糖（ADPG)為合成起始底物。在淀粉合酶 (8七3代1187111：1^86,55)的作用下，40?6通過€[-1，4糖苷鍵鏈接形成葡聚糖鏈，進而合成直 鏈淀粉；或進一步在淀粉分支酶/淀粉去分支酶的作用下，通過a -1，6糖苷鍵產(chǎn)生分支，形 成支鏈淀粉。淀粉合酶包含顆粒結(jié)合淀粉合酶（granule-bound starch synthase，GBSS)和 可溶性淀粉合酶。不同SS酶在淀粉合成過程中的作用、催化底物及其組織分布各不相同。 GBSS I與淀粉粒緊密結(jié)合，主要作用于直鏈淀粉，由waxy基因編碼。而可溶性淀粉合酶部 分存在于質(zhì)體基質(zhì)中，部分與淀粉粒結(jié)合，催化支鏈淀粉的延伸，且不同SS同工型的特性 和在淀粉合成中的作用各不相同。SS I、SS II、SSIII分別優(yōu)先延長短鏈OP6-10)、中等鏈 (DP11-24)、長鏈（DP25-35) (Keeling and Myers 2010 ;Zeeman et al. 2010)。以 SS II酶 為例，單子葉植物中有SS II a和SS II b兩種同工酶，SS II a存在于胚乳中，而SS II b分 布于葉片等光合組織中。六倍體禾谷類作物小麥中一個或多個SS II a酶缺失將使較短的 分支鏈（DP6-10)數(shù)量增加，中等長度的分支鏈（DP11-24)數(shù)量減少（Shimbata等，2005)。
[0004] 對SSIV的功能研宄目前主要集中在擬南芥上，研宄表明SS IV可能在淀粉粒的合 成起始反應(yīng)中起重要作用（Crumpton-Taylor et al.2013)。擬南芥AtssIV基因功能缺失 突變體的每個葉綠體中僅合成1個大的淀粉粒（Roldan et al.2007)，而AtssIII和AtssIV 基因雙缺失突變的葉綠體中則沒有任何淀粉粒合成，表明SSIV在淀粉粒起始合成和淀粉 累積過程中都起著重要的作用（Szydlowski et al.2009)。白天/光照條件下，AtSSIV基 因的過量表達導(dǎo)致葉片中過渡淀粉增加，而增加的這些淀粉在夜晚/黑暗條件下全部轉(zhuǎn)換 為植物生長所必需的碳素，從而提高了植株的生長速率。過表達AtSSIV基因的馬鈴薯產(chǎn)量 和塊莖中儲藏淀粉的含量均有顯著提高，分析表明AtSSIV基因表達量的增加使AGP和SuSy 活性增強、酸性轉(zhuǎn)換酵素活性降低、ADPG含量增加，推測產(chǎn)量及淀粉含量的增加是這一系列 酶活性增強共同作用產(chǎn)生的結(jié)果（Gamez-Arjona et al.2011)。
[0005] 小麥的SSIV基因僅在葉片和胚中表達，而不在胚乳中表達（Leterrier et al. 2008)，但SSIV在小麥過渡淀粉或淀粉合成中的作用及其對生長過程甚至產(chǎn)量形成的 影響還沒有深入細致的研宄，創(chuàng)制和挖掘SSIV基因新等位變異及其缺失突變體是研宄 SSIV功能的重要途徑。SSIV蛋白的N端第1~405位氨基酸為其區(qū)別于其他淀粉合酶的 特異序列，含有2個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和1個1433蛋白識別位點（Leterrier et al. 2008)， 該區(qū)域堿基突變將導(dǎo)致基因功能變異。因此，在上述區(qū)域挖掘出SSIV基因新等位變異及其 缺失突變體將促進SSIV功能的深入研宄。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為滿足上述領(lǐng)域的需求，本發(fā)明提供一對用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變 異檢測的引物及使用所述引物檢測小麥TaSSIV等位變異的方法。本發(fā)明請求保護的技術(shù) 方案如下：
[0007] 用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物，其核苷酸序列為：
[0008] SSIV-lbF:5'GGTAGGAATGATACAGAACACC3' ；
[0009] SSIV-lbR:5,ACTAAAACCCACTTTGCGAC3，。
[0010] 用于檢測小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異的方法，包括如下步驟：
[0011] ⑴以小麥突變?nèi)后w為材料，提取基因組DNA;
[0012] (2)混合小麥突變?nèi)后w中不同株系的基因組DNA，構(gòu)建樣本池；
[0013] (3)以每個樣本池的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物及其熒光引物 進行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物；
[0014] 所述熒光引物為：在權(quán)利要求1所述引物的基礎(chǔ)上，在引物SSIV-lbF上添 加IRdye700熒光標記獲得的熒光引物SSIV-lbFIRdye700,在引物SSIV-lbR上添加 IRdye800熒光標記獲得熒光引物SSIV-lbRIRdye800;
[0015] (4)采用特異性限制性內(nèi)切酶對步驟（3)獲得的PCR產(chǎn)物進行酶切反應(yīng)，得到酶切 產(chǎn)物；
[0016] (5)進行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用Li-C〇r 4300DNA遺傳分析系統(tǒng)檢測步驟 ⑷獲得的酶切產(chǎn)物，得到兩張電泳圖片，A圖包含IRdye700熒光標記，B圖包含IRdye800 熒光標記；
[0017] (6)若A圖中DNA片段大小與B圖中DNA片段大小的和等于1191bp，即可初步判 斷該片段所來自的樣本池中含有特異酶切片段，即等位變異；
[0018] (7)以初步判斷含有特異酶切片段的樣本池的原始樣本基因組DNA為模板，采用 權(quán)利要求1所述的引物進行PCR反應(yīng)、測序驗證所述等位變異。
[0019] 所述混合指將誘變?nèi)后w中不同株系的基因組DNA兩兩等量混合。
[0020] 所述權(quán)利要求1所述的引物及其熒光引物的混合比例為：SSIV-lbF:SSIV-lbF IRdye700:SSIV-lbR:SSIV-lbRIRdye800 = 4:1:1:4〇
[0021] 所述特異性限制性內(nèi)切酶是CELI酶，所述酶切反應(yīng)的條件為45°C酶切15min。
[0022] 所述 PCR 反應(yīng)的 10 y 1 體系為：10XBuffer 0? 5 y 1 ;1. 5mmol/L Mg2+;0. 2mmol/L dNTP ;0. 25mmol/L 引物；高保真 DNA 聚合酶 0. 5U ;200ng 模板 DNA。
[0023] 所述PCR反應(yīng)的程序為：95°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，66°C退火30s，以0. 5°C/ s的速度升至72°C并延伸lmin，8個循環(huán)，每循環(huán)的退火溫度比上一循環(huán)降低1°C ;94°C變性 30s，58°C退火30s，以0. 5°C /s的速度升至72°C并延伸lmin，35個循環(huán)；72°C總延伸5min ; 99°C變性lOmin ;70°C退火20s，70個循環(huán)，每循環(huán)的溫度比上一循環(huán)降低0. 3°C。
[0024] SSIV蛋白的N端第1~405位氨基酸為其區(qū)別于其他淀粉合酶的特異序列，含有2 個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域和1個1433蛋白識別位點，該區(qū)域的堿基突變將導(dǎo)致基因功能變異。由 于普通小麥為六倍體，而該區(qū)域又高度保守，為檢測小麥該區(qū)域的突變體，只有設(shè)計篩選出 特異性極好的引物進行PCR電泳，才能將發(fā)生等位突變的同源染色體與其它同源染色體區(qū) 分開來，從而擴增到可通過凝膠電泳及測序的方法檢測出的等位突變。本發(fā)明經(jīng)過設(shè)計和 篩選，提供一對用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物，所述引物的擴增區(qū)域 為TaSSIV基因的第3外顯子的一部分和第4~5外顯子以及第3~4內(nèi)含子區(qū)，擴增片段 的長度為1191bp，退火溫度為58°C，其核苷酸序列為：SSIV-lb F:5'GGT AGG AAT GAT ACA GAA CAC C 3';SSIV-lb R:5' ACT AAA ACC CAC ITT GCG AC 3'。試驗數(shù)據(jù)證明，該引物能 特異地檢測到TaSSIV等位突變，如實施例2,圖2和圖3所示，可有助于小麥SSIV的功能研 宄。
[0025] 所述等位變異指與野生型相比，淀粉合酶基因TaSSIV發(fā)生了單堿基突變?nèi)甾D(zhuǎn)換 或顛換，或者發(fā)生了小于10個堿基的小片段插入或缺失。
[0026] 本發(fā)明還提供一種用于檢測小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異的方法，利用該 方法能夠準確地從小麥突變?nèi)后w中檢測出TaSSIV等位變異位點。所述小麥突變?nèi)后w可以 是小麥干種子經(jīng)EMS(甲基磺酸乙酯）溶液處理后構(gòu)建的誘變?nèi)后w，也可以是自然產(chǎn)生的或 以其它本領(lǐng)域公知的誘變方式（例如疊氮化鈉誘變）產(chǎn)生的突變?nèi)后w。利用EMS誘變小 麥，優(yōu)選含〇. 7~1. 5% EMS 0. 1M磷酸緩沖液（pH7. 0)，根據(jù)所需等位變異的多少可對EMS 的濃度進行調(diào)整，濃度越高所獲得的等位變異越多。所述誘變?nèi)后w的大小可根據(jù)所需等位 變異的多少進行調(diào)整，群體越大所獲得的等位變異越多。種子經(jīng)EMS溶液處理后種植獲得 Mdf，植株抽穗后套袋自交獲得M 2代種子，將M2