代種子種植，取葉片提取單株小麥的基因組 DNA，每一株自交收獲種子。然后將誘變?nèi)后w中不同株系的基因組DNA兩兩等量混合構(gòu)建樣 本池。所述兩兩等量混合是將每個(gè)單株的DNA濃度稀釋為相同濃度后，每2個(gè)不同樣本取 相同體積，混合后構(gòu)建1個(gè)樣本池。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)小麥突變?nèi)后w的大小及所需等位變 異的數(shù)量，也可以選擇其它混合方式，例如，每個(gè)樣本池含有4或8份小麥基因組DNA。以每 個(gè)樣本池的基因組DNA為模板，采用本發(fā)明提供的引物SSIV-lb F、SSIV-lb R及其熒光引 物進(jìn)行PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物。采用芹菜中所含的CELI酶對(duì)所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶 切產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測獲得兩張電泳圖譜，若A圖中DNA片段大小與B圖 中DNA片段大小的和等于1191bp，那么所述片段對(duì)應(yīng)的樣本池中含有特異酶切片段，鑒定 其等位變異位點(diǎn)。對(duì)含有特異酶切片段的樣本池的原始基因組DNA進(jìn)行PCR，所述PCR的反 應(yīng)體系和程序與步驟（3)中PCR的反應(yīng)體系和程序相同。最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，驗(yàn)證 樣本所含的等位變異。
[0027] 綜上所述，本發(fā)明提供的用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物 SSIV-lb F和SSIV-lb R，利用所述引物，結(jié)合本發(fā)明用于檢測小麥淀粉合酶基因TaSSIV等 位變異的方法，能夠準(zhǔn)確檢測出小麥突變?nèi)后w中單株小麥的TaSSIV基因等位變異位點(diǎn)，為 小麥淀粉合酶基因TaSSIV的深入功能研宄奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0028] 圖1. 1. 0%EMS溶液誘導(dǎo)小麥產(chǎn)生的部分表型突變，
[0029] 其中，從上到下，從左到右依次為拔節(jié)期、旗葉寬度、株型、黃綠葉色、類斑、條紋葉 和抽穗期突變。
[0030] 圖2.以引物SSIV-lb擴(kuò)增小麥淀粉合酶基因TaSSIV電泳圖，
[0031] 其中，A含IRdye700標(biāo)記；B含IRdye800標(biāo)記；紅色方框?yàn)楹琁Rdye700標(biāo)記的特 異酶切片段，藍(lán)色方框?yàn)楹琁Rdye800標(biāo)記的特異酶切片段，二者長度相加為1191bp。
[0032] 圖3.部分突變株系序列比對(duì)圖
【具體實(shí)施方式】
[0033] 生物材料及來源：小麥推廣品種京411，已知品種，可商購，北京市小麥區(qū)域試驗(yàn) 原對(duì)照品種。
[0034] 上述生物材料本實(shí)驗(yàn)室亦有保存，可自申請(qǐng)日起二十年內(nèi)向公眾發(fā)放用于驗(yàn)證實(shí) 驗(yàn)。
[0035] 儀器設(shè)備：美國Li-Cor公司的Li-Cor 4300DNA遺傳分析系統(tǒng)。
[0036] 本發(fā)明未特別說明的實(shí)驗(yàn)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，或采用本領(lǐng)域常規(guī)方法配制 而得，可商購獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級(jí)即可。
[0037] 實(shí)施例1.EMS誘發(fā)小麥京411突變?nèi)后w
[0038] 1.實(shí)驗(yàn)材料與方法
[0039] 以含體積百分比為1 % EMS的0. 1M磷酸緩沖液（pH7. 0)處理小麥品種京411的干 種子，處理完成后，單粒點(diǎn)播種植獲得乂代，抽穗后套袋自交，單株收獲，每株取1粒種子， 用以構(gòu)建M 2群體。M 2代種子單粒點(diǎn)播于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研宄所中圃場試驗(yàn)基地， 行長2m，行距30cm，株距10cm，正常田間管理。苗期取葉片備用，每一株自交收獲種子，整個(gè) 生育期間田間調(diào)查表型變異，分析誘變?nèi)后w的誘變效率。
[0040] 2?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0041] 在仏群體的生長過程中，田間鑒定到拔節(jié)期、抽穗期、葉色、旗葉寬度、株型（圖 1)、千粒重等多種表型變異，在4400個(gè)株系中共篩選到296株突變體，總突變率為6. 73%。 從表型突變頻率分析，該群體突變率較高，推測其基因的等位變異率也相應(yīng)較高。
[0042] 實(shí)施例2.以引物SSIV-lb鑒定小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異
[0043] 1?弓丨物設(shè)計(jì)及合成
[0044] 綜合采用C00DLE軟件、primer 5軟件和NCBI網(wǎng)站在線引物設(shè)計(jì)功能，對(duì)NCBI網(wǎng) 站數(shù)據(jù)庫中小麥淀粉合酶基因TaSSIV(登錄號(hào)DQ400416. 1)第5內(nèi)含子前的卷曲螺旋結(jié)構(gòu) 域和1433蛋白識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增引物序列。該序列需滿足一般引物設(shè)計(jì)條 件，且退火溫度在55°C~65°C之間、擴(kuò)增區(qū)存在潛在突變位點(diǎn)。所設(shè)計(jì)序列經(jīng)人工合成后 首先在野生型樣品中擴(kuò)增驗(yàn)證其特異性，之后用于突變樣品的篩選鑒定。
[0045] 2?樣品池構(gòu)建
[0046] 用實(shí)施例1所取仏代單株葉片提取基因組DNA，并將每個(gè)樣品的濃度稀釋為40ng/ y 1，將DNA兩兩等量混合構(gòu)建樣品池。共提取1600個(gè)單株的DNA，構(gòu)建了 800個(gè)樣品池。
[0047] 3. PCR 擴(kuò)增
[0048] PCR擴(kuò)增時(shí)使用的引物為普通引物SSIV-lb F、SSIV-lb R與熒光標(biāo)記引物 SSIV-lb F IRdye700、SSIV-lb R IRdye800 的混合物，混合比例為 SSIV-lb F:SSIV-lb F IRdye700:SSIV-lb R:SSIV-lb R IRdye800 = 4:l:l:4。以每個(gè)樣品池的基因組 DNA 為模 板，按照下列體系和程序進(jìn)行PCR，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0049] PCR 體系（10y1):含 lOXBuffer 0? 5y1 ;1. 5mmol/L Mg2+;0. 2mmol/L dNTP ; 0. 25mmol/L引物；高保真DNA聚合酶0. 5U ;200ng模板DNA。
[0050] PCR 程序：
[0051]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物，其核苷酸序列為： SSIV-lb F :5' GGT AGG AAT GAT ACA GAA CAC C 3' ； SSIV-lb R :5' ACT AAA ACC CAC TTT GCG AC 3'。
2. 用于檢測小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異的方法，包括如下步驟： (1) 以小麥突變?nèi)后w為材料，提取基因組DNA; (2) 混合小麥突變?nèi)后w中不同株系的基因組DNA，構(gòu)建樣本池； (3) 以每個(gè)樣本池的基因組DNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物及其熒光引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物； 所述熒光引物為：在權(quán)利要求1所述引物的基礎(chǔ)上，在引物SSIV-lb F上添加IRdye700 熒光標(biāo)記獲得的熒光引物SSIV-lb F IRdye700,在引物SSIV-lb R上添加IRdye800熒光標(biāo) 記獲得熒光引物SSIV-lb R IRdye800; (4) 采用特異性限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟（3)獲得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn) 物； (5) 進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用Li-Cor 4300DNA遺傳分析系統(tǒng)檢測步驟（4) 獲得的酶切產(chǎn)物，得到兩張電泳圖片，A圖包含IRdye700熒光標(biāo)記，B圖包含IRdye800熒光 標(biāo)記； (6) 若A圖中DNA片段大小與B圖中DNA片段大小的和等于1191bp，即可初步判斷該 片段所來自的樣本池中含有特異酶切片段，即等位變異； (7) 以初步判斷含有特異酶切片段的樣本池的原始樣本基因組DNA為模板，采用權(quán)利 要求1所述的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)、測序驗(yàn)證所述等位變異。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述混合指將誘變?nèi)后w中不同株系的基因組DNA兩兩 等量混合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述權(quán)利要求1所述的引物及其熒光引物的混合比例 為：SSIV-lb F:SSIV-lb F IRdye700:SSIV-lb R:SSIV-lb R IRdye800 = 4:l:l:4。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述特異性限制性內(nèi)切酶是CELI酶，所述酶切反應(yīng)的 條件為45°C酶切15min。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述PCR反應(yīng)的10 y 1體系為：10 XBuffer 0. 5 y 1 ; 1. 5mmol/L Mg2+；0. 2mmol/L dNTP ；0. 25mmol/L 引物；高保真 DNA 聚合酶 0? 5U ;200ng 模板 DNA〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性5min ;94°C變性 30s，66°C退火30s，以0.5°C /s的速度升至72°C并延伸lmin，8個(gè)循環(huán)，每循環(huán)的退火溫 度比上一循環(huán)降低1°〇;94°〇變性308,581：退火308，以0.51：/8的速度升至721：并延伸 lmin，35個(gè)循環(huán)；72°C總延伸5min ;99°C變性lOmin ;70°C退火20s，70個(gè)循環(huán)，每循環(huán)的溫 度比上一循環(huán)降低0.3 °C。
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于小麥淀粉合酶基因TaSSIV等位變異檢測的引物SSIV-1b及其檢測方法，屬于植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。所述引物的核苷酸序列為：SSIV-1b F：5’GGT AGG AAT GAT ACA GAA CAC C 3’；SSIV-1b R：5’ACT AAA ACC CAC TTT GCG AC 3’，其擴(kuò)增區(qū)域包含TaSSIV基因的第3外顯子的一部分和第4～5外顯子以及第3～4內(nèi)含子區(qū)，擴(kuò)增片段長度1191bp。利用所述引物及本發(fā)明提供的檢測方法，可以準(zhǔn)確檢測出小麥突變?nèi)后w中相應(yīng)區(qū)域的等位變異位點(diǎn)，從而在小麥淀粉合酶基因新等位變異的發(fā)掘過程中發(fā)揮重要作用。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104673923
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510117185
【發(fā)明人】劉錄祥, 郭會(huì)君, 李曉, 閆智慧, 謝永盾, 趙林姝, 古佳玉, 趙世榮, 李軍輝
【申請(qǐng)人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所
【公開日】2015年6月3日
【申請(qǐng)日】2015年3月17日