檢測braf和pi3k突變的方法
【專利說明】檢測BRAF和PI3K突變的方法
[0001] 發(fā)明背景
[0002] B-raf (或BRAF)是Ras/Raf/MEK/MAP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的部分并在調(diào)節(jié)MAP激酶/ERK 信號通路中發(fā)揮作用。該基因的突變與多種癌癥相關(guān)，比如結(jié)直腸癌（CRC)，非小細胞肺癌 (NSCLC)，惡性黑色素瘤和腺癌。
[0003] 在結(jié)腸癌中，已經(jīng)報道了 BRAF中的致癌突變，其幾乎所有都是V600E突變（Davies H，等人，2002, Nature 417:949-54 ;Rajagopalan H，等人，2002, Nature 418:934)。V600E 突變位于BRAF基因的外顯子15上：在BRAF編碼序列的位置1799, T變?yōu)锳，其導(dǎo)致從存在 于野生型BRAF蛋白中的纈氨酸（V)，變?yōu)榕c突變基因?qū)?yīng)的蛋白中的谷氨酰胺（E)。還檢 測到V600K突變（1798-1799 GT > AA)，但不那么大量，并且構(gòu)成病理學(xué)比如黑素瘤中量第 二大的突變（Rubinstein 等人，2010，Journal of Translational Medicine 8,未給出頁 數(shù)）。其它鑒定的BRAF基因突變是V600D，V600M和V600A。
[0004] 磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)通路在很多細胞過程中發(fā)揮重要作用，所述細胞過程 包括細胞增殖、粘附、存活和運動性。已經(jīng)在很多類型的人惡性疾病中觀察到此通路的失調(diào) 并且通常與通路成分的遺傳改變相關(guān)。此種遺傳改變包括在PI3K、PIK3CA的pi 10亞單位 中激活突變（Hurst等人，2009, BMC Research Notes 2:66)。多數(shù)PI3K突變或者存在于 PIK3CA的外顯子9 (其編碼螺旋結(jié)構(gòu)域）中，或者存在于PIK3CA的外顯子20 (其編碼激酶 結(jié)構(gòu)域）中（Engelman，2009，Nat. Rev. Cancer 9:550-562)。上文提及的外顯子中的四種 常見PI3K突變是E542K，E545D，E545K(它們中三個位于外顯子9中）和H1047R(外顯子 20) 〇
[0005] 近期的出版物提示，BRAF和PI3K中的突變可能對抗-EGFR治療產(chǎn)生抗性（Lurkin 等人，2010，PLoS ONE，5，（1) ;De Roock 等人，2010，Lancet Oncol. 11 :753_62 ;De Roock 等人，2011，Lancet Oncol. 12 :594_603 ;Bardelli & Sienna，2010, J Clin Oncol ;28 (7): 1254-1261)。特別是顯示，BRAF中突變損害患有mCRC的患者中對帕尼單抗（panitumumab) 或西妥昔單抗（cetuximab)的響應(yīng)（Di Nicolantonio F 等人，2008，J. Clin. Oncol. 26: 5705-5712)，突變BRAF的存在表示對mCRCs的消極預(yù)后因素。當前的數(shù)據(jù)還提示，BRAF 和PI3K改變的評價可能用于選擇不可能響應(yīng)抗-EGFR-祀向的抗體的患有mCRC的患者 (Bardelli & Sienna, 2010, J Clin Oncol ；28(7) ：1254-1261)〇
[0006] 存在高的對于檢測PI3K和BRAF基因突變的方法的需求。近來，已經(jīng)公開了與對 抗-EGFR治療的響應(yīng)相關(guān)的同時檢測基因突變的方法（Lurkin等人，2010, PLoS 0NE，5， ⑴）。所述方法包括分析外顯子9和20中的PI3K突變，以及分析外顯子15中的BRAF突 變?？偟膩碚f，設(shè)計兩個多重PCRs ;第一個包含一對擴增BRAF外顯子15的引物；并且第二 個包含兩對擴增PI3K外顯子9和20的引物。接著，將獲得的PCR產(chǎn)物進行純化、變性并與 探針孵育，所述探針與相應(yīng)擴增產(chǎn)物的一條鏈在臨近突變位點的位置雜交。隨后在熱循環(huán) 儀中進行延伸反應(yīng)，其中僅互補于樣品中存在的突變的ddNTP被整合入延伸產(chǎn)物，并且用 自動測序儀檢測。
[0007] 這些基因的中的其它突變檢測方法，包括實時ARMS (amplification refractory mutation system，擴增阻礙突變系統(tǒng)）測定，比如在Ellison等人，2010，Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 29 :132 中公開的那些。
[0008] ARMS是基于等位基因-特異性的PCR擴增起始原理的檢測點突變的方法 (EP0332435;Newton 等人，1989, Nucleic Acid Research 17,2503-2516)。該系統(tǒng)基于這 樣的策略，其中設(shè)計各個寡核苷酸引物或引物，從而只有當它與其相應(yīng)特異性靶標DNA序 列退火時，其才作為用于PCR的引物發(fā)揮作用。該技術(shù)需要所述PCR引物的末端3' -核苷 酸是等位基因特異性的。這意味著，所述末端3'-核苷酸對應(yīng)于點突變的那個。因此，以兩 種形式設(shè)計引物：阻礙"突變" DNA模板PCR擴增的"正常"形式，和阻礙"正常" DNA PCR擴 增的"突變"形式。
[0009] 在一些情況中，當有對應(yīng)于另一個點突變的DNA作為靶點時，單個3'-錯配堿基不 完全阻止寡核苷酸引物的非特異性延伸，并且擴增繼續(xù)。在這種情況中，在等位基因-特異 性的適當引物的3'末端附近故意引入錯配（在從引物3'末端數(shù)第二、第三或甚至第四個 核苷酸處）使得增強引物的特異性。
[0010] ARMS技術(shù)包括，在一種反應(yīng)混合物中可能發(fā)生至少兩種PCR，各自對應(yīng)于使用一 種ARMS引物的擴增。任意ARMS引物還需要第二引物（通常被稱為"普通引物"，并且其在 下文將被稱為"擴增引物"）來產(chǎn)生等位基因-特異性的產(chǎn)物。
[0011] 樣品中特異性靶序列的存在通過瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠染色后產(chǎn)物的可 視化來顯示。備選地，結(jié)果可以以實時、封閉管的形式通過整合熒光探針諸如Taqman， Scorpions，分子信標（Molecular beacons)或插入焚光染料諸如Yo-Pro或Sybr綠（Sybr green)來分析。
[0012] 當前工藝水平常處理檢測BRAF突變V600E和V600K，以及PI3K突變E542K，E545D， E545K和H1047R的問題。然而，就我們所知，當前工藝水平中已有的檢測方法中，沒有一個 允許通過其與特異性探針的雜交檢測獲自這些突變的任意擴增產(chǎn)物。這是由于這樣的事 實：由于它們之間的序列相似性，可能設(shè)計用于與對應(yīng)于這些基因之一一種突變的任意擴 增產(chǎn)物雜交的任意探針，也會非特異性結(jié)合相同基因中臨近突變的擴增產(chǎn)物。由此，當前工 藝水平的BRAF和PI3K突變檢測方法具有這樣的缺點：獲得的任意擴增產(chǎn)物的檢測不能通 過將前者與突變-特異性的探針，并且特別是與含有這種探針的微陣列雜交來進行。
[0013] 該缺點適用于多重ARMS擴增方法，以及個體ARMS擴增方法，其中來自各個突變的 特異性擴增產(chǎn)物在獨立的反應(yīng)容器中獲得。
[0014] 另一個相關(guān)問題是，可以作為腫瘤分期、轉(zhuǎn)移、發(fā)展、細胞異質(zhì)性或等位基因異質(zhì) 性的預(yù)后因素存在的BRAF和PI3K突變，就野生型而言，在樣品中常常以低豐度被發(fā)現(xiàn)。并 且，盡管很多診斷方法對于突變檢測是可用的，但多數(shù)不能準確地檢測低豐度突變。Sanger 測序是突變鑒定的金標準，盡管其僅可以檢測豐度超過大約20%的突變（Ogino等人， 2005, J. Mol. Diagn. 7 :413-421 ;Li 等人，2008, Nat. Med. 14 :579-584)。
[0015] 因此，高度需要提供這樣的方法，該方法不同于當前工藝水平的方法，該方法允許 通過將相應(yīng)擴增產(chǎn)物與靶標特異性的探針雜交，特異性檢測獲自樣品中存在的任意BRAF 突變V600E和V600K，以及PI3K突變E542K，E545D，E545K和H1047R的任意擴增產(chǎn)物。還 需要，所述方法允許檢測樣品內(nèi)以低百分數(shù)存在的突變。因此，本文描述的發(fā)明旨在提供強 的和可靠的檢測BRAF和PI3K突變的方法，并且因此旨在減輕現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明提供存在于樣品中的2種BRAF突變V600E和V600K中任一種，和/或4種 PI3K突變E542K，E545D，E545K和H1047R中任一種的檢測方法，所述方法通過將獲自具有 這些突變中任一種的核酸的擴增產(chǎn)物與靶標特異性的探針雜交進行。
[0018] 本發(fā)明基于以一種或多種本發(fā)明的ARMS引物擴增樣品中存在的2種BRAF突變 V600E和V600K中的一種或多種和/或4種PI3K突變E542K，E545D，E545K和H1047R中的 一種或多種。
[0019] 本發(fā)明的ARMS引物特征在于：各引物具有36至50個核苷酸的總長度，其3'末端 根據(jù)ARMS擴增方法（擴增阻礙突變系統(tǒng)，基于PCR擴增的等位基因-特異性引發(fā)的原理檢 測點突變的方法）設(shè)計，并且該3'末端在BRAF V600E和V600K突變的情況中分別構(gòu)成選 自SEQ ID N。1和SEQ ID N。2的靶標特異性序列，和在PI3K突變E542K，E545D，E545K 和 H1047R 的情況中分別構(gòu)成選自 SEQ ID N° 12，SEQ ID N° 13，SEQ ID N° 14,和 SEQ ID N° 15的靶標特異性序列，各引物還包含15至20個核苷酸的不同的非靶標特異性5'標簽 序列。
[0020] 因此，本發(fā)明方法中使用的ARMS引物在3'末端包含靶標特異性序列，所述靶標特 異性序列能夠以等位基因特異性的方式雜交于包含如上所述的突變的靶標核酸。該引物還 包含5'序列，所述5'序列不是靶標特異性的并且因此不互補于所述靶標核酸。該序列是 標簽序列，其用于通過接著與特別設(shè)計以雜交于擴增產(chǎn)物中與所述標簽序列互補的區(qū)域的 探針雜交檢測擴增產(chǎn)物。這允許通過本文描述的方法特異性檢測擴增產(chǎn)物。
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