0021] 本發(fā)明的方法允許通過將這種產(chǎn)物與一種或多種探針雜交，所述探針在由特異性 引物提供的標(biāo)簽對應(yīng)的區(qū)域特異性與所述產(chǎn)物雜交，特異性檢測獲自樣品中存在的2種 BRAF 突變 V600E 和 V600K 和 / 或 PI3K 突變 E542K，E545D，E545K 和 H1047R 中的任一種的 任意擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0022] 不同引物的5'標(biāo)簽序列彼此間均是不同的。該差異是使得不同的擴(kuò)增產(chǎn)物特異 性結(jié)合于其相應(yīng)探針的原因，對于特異性于擴(kuò)增產(chǎn)物之一的任意探針，必須具有能夠至少 雜交于產(chǎn)物中對應(yīng)于相應(yīng)標(biāo)簽的區(qū)域的核苷酸序列。
[0023] 整個本專利說明書中，根據(jù)ARMS擴(kuò)增方法在其3'末端設(shè)計的這些突變-特異性 弓丨物將命名為"ARMS引物"。另外，用于靶標(biāo)DNA擴(kuò)增的引物或與ARMS引物組合的引物，通 常也被稱為普通引物，將在下文中命名為"擴(kuò)增引物"。用于本發(fā)明BRAF和PI3K突變的特 異性ARMS引物，可以如表1中指出的描述。
[0024]
【主權(quán)項】
1. 檢測一種或多種選自V600E和V600K的BRAF突變，和/或一種或多種選自E542K， E54抓，E545K和化047R的PI3K突變的方法，其中所述方法包括W下步驟： -將包含核酸的測試樣品用擴(kuò)增混合物擴(kuò)增，所述擴(kuò)增混合物包含一種或多種ARMS 引物，特征在于各ARMS引物具有36至50個核巧酸的總長度，并且分別包含選自SEQ ID N。1，沈Q ID N。2,沈Q ID N。12,沈Q ID N。13,沈Q ID N。14 和沈Q ID N。15 的 3'祀標(biāo)特異性序列， 各ARMS引物還包含15至20個核巧酸的不同的非祀標(biāo)特異性5'標(biāo)簽序列， 所述擴(kuò)增混合物還包含一種或多種擴(kuò)增引物；和 -通過將獲得的任何擴(kuò)增產(chǎn)物與一種或多種探針雜交來檢測任何所述產(chǎn)物，其中各探 針與所述擴(kuò)增產(chǎn)物中對應(yīng)于相應(yīng)ARMS引物的5'標(biāo)簽序列的區(qū)域特異性雜交。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中一種或多種ARMS引物選自SEQ ID r 3，SEQ ID r 4， 沈Q ID N。16,沈Q ID N。17,沈Q ID N。18 和沈Q ID N。19。
3. 權(quán)利要求1和2所述的方法，其中與一種或多種ARMS引物組合的一種或多種擴(kuò)增引 物包含18至24個核巧酸，并且當(dāng)與所述一種或多種ARMS引物組合時，擴(kuò)增產(chǎn)生一種或多 種lOOObp或更短的產(chǎn)物。
4. 權(quán)利要求1至3任一項所述的方法，其中所述擴(kuò)增引物是： -包含SEQ ID r 5或由SEQ ID r 5組成的引物，其用于與一種或多種W下ARMS引 物一起擴(kuò)增： -36至50個核巧酸的引物，所述引物包含選自SEQ ID r 1和SEQ ID r 2的3'祀 標(biāo)特異性序列，所述引物還包含15至20個核巧酸的非祀標(biāo)特異性5'標(biāo)簽序列；和 -SEQ ID N。3 和 SEQ ID N。4 的引物； -包含SEQ ID r 20或由SEQ ID r 20組成的引物，所述引物用于與一種或多種W 下ARMS引物一起擴(kuò)增： -36至50個核巧酸的引物，所述引物包含選自SEQ ID r 12，SEQ ID r 13和SEQ ID r 14的3'祀標(biāo)特異性序列，所述引物還包含15至20個核巧酸的非祀標(biāo)特異性5'標(biāo) 簽序列；和 -SEQ ID N。16, SEQ ID N。17 和 SEQ ID N。18 的引物； -包含SEQ ID r 21或由SEQ ID r 21組成的引物，所述引物用于與一種或多種W 下ARMS引物一起擴(kuò)增： -36至50個核巧酸的引物，所述引物包含3'祀標(biāo)特異性序列SEQ ID r 15,所述引物 還包含15至20個核巧酸的非祀標(biāo)特異性5'標(biāo)簽序列；和 -SEQIDN。19 的引物。
5. 權(quán)利要求1至4任一項所述的方法，其中所述擴(kuò)增混合物包含DNA聚合酶和dNTPs。
6. 權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其中使用W下引物組合中的一、二、S或四種： -沈Q ID N。3,沈Q ID N。4 和沈Q ID N。5 ; -沈Q ID N。16,沈Q ID N。19,沈Q ID N。20 和沈Q ID N。21 ; -沈Q ID N。17,沈Q ID N。18 和沈Q ID N。20 ; -沈Q ID N。16,沈Q ID N。17,沈Q ID N。18,沈Q ID N。19,沈Q ID N。20 和沈Q ID N° 21。
7. 權(quán)利要求1至6任一項所述的方法，其中與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交的一種或多種探針具有15 至45個核巧酸的長度，并且包含選自SEQ ID r 6，SEQ ID r 7，SEQ ID r 22，SEQ ID N° 23，SEQ ID N° 24 和 SEQ ID N° 25 的組的序列。
8. 權(quán)利要求1至7任一項所述的方法，其中一種或多種探針選自SEQ ID r 8，SEQ ID N° 9,沈Q ID N° 10,沈Q ID N° 11，沈Q ID N° 26,沈Q ID N° 27,沈Q ID N° 28,沈Q ID N° 29 和沈Q ID N° 30。
9. 一種檢測包含核酸的測試樣品中一種或多種選自V600E和V600K的BRAF突變，和/ 或一種或多種選自E542K，E54抓，E545K和化047R的PI3K突變的試劑盒，其中所述試劑盒 包含一種或多種用于核酸擴(kuò)增的試劑的混合物，各混合物包含： -一種或多種ARMS引物，其特征在于各引物具有36至50個核巧酸的長度，分別包含選 自沈Q ID N。1，沈Q ID N。2,沈Q ID N。12,沈Q ID N。13,沈Q ID N。14 和沈Q ID r 15的3'祀標(biāo)特異性序列， 各引物還包含15至20個核巧酸的不同的非祀標(biāo)特異性5'標(biāo)簽序列，和 -一種或多種擴(kuò)增引物， 所述試劑盒還包含微陣列，其中一種或多種探針被固定，各探針與相應(yīng)ARMS產(chǎn)物中與 相應(yīng)ARMS引物的5'標(biāo)簽序列互補(bǔ)的區(qū)域特異性雜交。
10. 權(quán)利要求9所述的試劑盒，其中一種或多種探針具有15至45個核巧酸的長度，并 且包含選自沈Q ID r 6,沈Q ID r 7,沈Q ID r 22,沈Q ID r 23,沈Q ID r 24和 SEQ ID N° 25 的序列。
11. 權(quán)利要求9和10所述的試劑盒，所述試劑盒包含一種或多種W下擴(kuò)增混合物： -包含SEQ ID r 3，SEQ ID r 4和SEQ ID r 5的引物的擴(kuò)增混合物； -包含 SEQ ID N° 16, SEQ ID N° 19, SEQ ID N° 20 和 SEQ ID N° 21 的引物的擴(kuò)增 混合物； -包含SEQ ID N° 17, SEQ ID N° 18和SEQ ID N° 20的引物的擴(kuò)增混合物；和 -包含 SEQ ID N。16, SEQ ID N。17, SEQ ID N。18, SEQ ID N。19, SEQ ID N。20 和SEQ ID r 21的引物的擴(kuò)增混合物； 所述試劑盒還包含 -微陣列，所述微陣列包含一種或多種選自SEQ ID r 8，SEQ ID r 9，SEQ ID r 10， 沈Q ID N。11，沈Q ID N。26,沈Q ID N。27,沈Q ID N。28,沈Q ID N。29 和沈Q ID N。30的探針。
12. 對應(yīng)于一種或多種選自V600E和V600K的BRAF突變，和/或一種或多種選自 E542K，E54抓，E545K和化047R的PI3K突變的核酸的擴(kuò)增方法，其中所述方法包括將含有核 酸的樣品與擴(kuò)增混合物相接觸，所述擴(kuò)增混合物包含一種或多種ARMS引物，特征在于各個 ARMS引物具有36至50個核巧酸的總長度，并且分別包含選自SEQ ID r 1，SEQ ID r 2， SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 14 和 SEQ ID N° 15 的 3' 祀標(biāo)特異性序列， 各個ARMS引物還包含15至20個核巧酸的不同的非祀標(biāo)特異性5'標(biāo)簽序列， 所述擴(kuò)增混合物還包含一種或多種擴(kuò)增引物。
13. -種36至50個核巧酸長度的ARMS引物，其特征在于，所述引物在其3'末端包含 選自SEQ ID r 1和SEQ ID r 2的BRAF祀標(biāo)特異性序列，或選自SEQ ID r 12，SEQ ID r 13，SEQ ID r 14和SEQ ID r 15的PI3K祀標(biāo)特異性序列， 和在其5'末端的15至20個核巧酸的非祀標(biāo)特異性標(biāo)簽序列。
14. 權(quán)利要求13所述的引物，所述引物選自包含SEQ ID r 3，SEQ ID r 4，SEQ ID N。16,沈Q ID N。17,沈Q ID N。18 和沈Q ID N。19 的組。
15. 權(quán)利要求1至8所述的檢測BRAF和/或PI3K突變的方法，或權(quán)利要求9至11所 述的試劑盒，或權(quán)利要求12所述的擴(kuò)增方法，或權(quán)利要求13和14所述的引物，用于患者中 病理狀況的診斷和/或預(yù)后，或用于預(yù)測患者對用抗-EGFR抗體治療的響應(yīng)的用途。
【專利摘要】本發(fā)明是基于在懷疑含有一種或多種BRAF突變V600E和V600K以及PI3K突變E542K，E545D，E545K和H1047R的樣品中所述突變的檢測方法，所述方法基于用本發(fā)明的引物對樣品進(jìn)行擴(kuò)增。另外，本發(fā)明涉及用于患者病理狀態(tài)尤其是癌癥的診斷/預(yù)后的(i)試劑盒，所述試劑盒在其成分中包含擴(kuò)增試劑，所述擴(kuò)增試劑包括一種或多種本發(fā)明的引物；(ii)引物本身；和(iii)上述方法、試劑盒和引物的用途。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104685070
【申請?zhí)枴緾N201380047560
【發(fā)明人】瑪麗亞·路易莎·比利亞埃爾莫薩, 胡安·莫斯科索德爾普拉多
【申請人】基諾米加公司
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2013年9月20日
【公告號】CA2884869A1, EP2711432A1, EP2898093A1, WO2014044828A1