線(xiàn)粒體dna拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可檢測(cè)線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異性、 進(jìn)而應(yīng)用于癌癥早期診斷篩查的裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 癌癥是惡性腫瘤的統(tǒng)稱(chēng)，癌細(xì)胞的特點(diǎn)是無(wú)限制、無(wú)止境地增生，使患者體內(nèi)的營(yíng) 養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗；癌細(xì)胞釋放出多種毒素，使人體產(chǎn)生一系列癥狀；癌細(xì)胞還可轉(zhuǎn)移到 全身各處生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致人體消瘦、無(wú)力、貧血、食欲不振、發(fā)熱，最終還可破壞組織、器官的 結(jié)構(gòu)和功能，引起壞死出血合并感染，患者最終由于器官功能衰竭而死亡。
[0003]目前雖然已出現(xiàn)了通過(guò)檢測(cè)基因的突變位點(diǎn)，用來(lái)指導(dǎo)用藥以及作為癌癥早篩的 標(biāo)準(zhǔn)，但是該方法主要的應(yīng)用是發(fā)現(xiàn)癌癥病人中腫瘤組織的突變情況，以便進(jìn)行個(gè)性化治 療；但不同癌癥病人基因突變位點(diǎn)不一樣，突變的頻率也有差異，很難確定癌癥的判別標(biāo) 準(zhǔn)，所以使用這個(gè)技術(shù)用于癌癥的篩查特異性和準(zhǔn)確率不高。
[0004] 人體血液中存在大量游離的DNA(cfDNA，cellfreeDNA)，它們主要來(lái)自體細(xì)胞 的凋亡、壞死或主動(dòng)釋放。目前已知癌癥病人的cfDNA含量顯著高于正常人，平均約為正 常人的三倍以上。癌癥病人的cfDNA中有一部分來(lái)自于腫瘤組織，這部分DNA也被成為 ctDNA(circulatingtumorDNA)，在癌癥發(fā)展的早期就能檢測(cè)到。線(xiàn)粒體DNA(chrM)在頭頸 部腫瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及食管鱗癌中表現(xiàn)為升高，而在胃癌、 乳腺癌、Ewing's肉瘤、肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌和腎細(xì)胞癌中則表現(xiàn)為拷貝數(shù)降低。更為 重要的是，線(xiàn)粒體DNA含量的變化還與某些腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切 相關(guān)。目前已報(bào)道的對(duì)于線(xiàn)粒體DNA的定量PCR技術(shù)存在以下不足之處：（1)只截取chrM 的一段作為chrM整體的指標(biāo)，隨機(jī)誤差大；（2)只能作為獨(dú)立指標(biāo)，無(wú)法和樣品內(nèi)其他DNA 含量進(jìn)行對(duì)照分析；（3)采用模型擬合的方法進(jìn)行定量，影響因素很多，不同模型，不同實(shí) 驗(yàn)流程產(chǎn)生的結(jié)果不一致；(4)對(duì)chrM的測(cè)量單位的定義不確定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于分子生物學(xué)測(cè)序技術(shù)，對(duì)血液中的游離DNA進(jìn)行 全基因組測(cè)序，通過(guò)識(shí)別線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)的異常情況來(lái)判斷受檢者罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)的檢 測(cè)裝置。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢 測(cè)裝置包括：測(cè)序單元，其對(duì)待檢者血漿樣本中的游離DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序，得到待檢樣 本的測(cè)序結(jié)果；計(jì)算單元，其將待檢樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類(lèi)參考基因組上，計(jì)算待檢樣 本的線(xiàn)粒體DNA拷貝指數(shù)；比較判斷單元，其將待檢樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝指數(shù)與預(yù)先設(shè)定 的診斷界限值進(jìn)行比較，判斷待檢樣本是否存在線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異性。
[0007] 進(jìn)一步地，由于線(xiàn)粒體DNA含量的變化與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化、腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移以及預(yù) 后密切相關(guān)，因而比較判斷單元還可進(jìn)一步根據(jù)待檢樣本是否存在線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異 性，判斷待檢者罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。
[0008] 上述線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置將分子生物學(xué)測(cè)序技術(shù)與生物信息分 析技術(shù)相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)對(duì)癌癥的早期診斷。使用該裝置進(jìn)行癌癥篩查時(shí)，只需抽取檢測(cè)對(duì) 象的血液樣本，從血漿中抽提游離的DNA作為待檢樣本；通過(guò)裝置中的測(cè)序單元對(duì)游離DNA 進(jìn)行全基因組測(cè)序、然后通過(guò)裝置中的計(jì)算單元將測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類(lèi)參考基因組上，計(jì) 算得到待檢樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝指數(shù)；通過(guò)比較判斷單元將待檢樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝 指數(shù)與預(yù)先設(shè)定的診斷界限值進(jìn)行比較，來(lái)判斷待檢樣本是否存在線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異 性，進(jìn)而判別待檢者是否處于癌癥高危狀態(tài)，從而實(shí)現(xiàn)癌癥的早期無(wú)創(chuàng)篩查或治療效果評(píng) 估。由于幾乎所有的惡性實(shí)體瘤都存在線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異，通過(guò)將分子生物學(xué)測(cè)序結(jié) 果序列比對(duì)到人類(lèi)參考基因組的線(xiàn)粒體DNA上的測(cè)序條數(shù)情況，即可以反映線(xiàn)粒體DNA拷 貝數(shù)的異常情況。線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)的異常也是判斷良性和惡性腫瘤的重要指標(biāo)，所以本 發(fā)明的實(shí)施方式所提供的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置既具備癌癥的特異性（在各 類(lèi)疾病中只有惡性腫瘤存在線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)異常），也具備對(duì)各類(lèi)癌癥的通用性（幾乎所 有的癌癥都存在線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)異常）。
[0009] -方面，作為一種對(duì)線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)的定量裝置，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的 該種檢測(cè)裝置在對(duì)線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)的定量方式上具備以下特點(diǎn)：首先，對(duì)線(xiàn)粒體DNA的定 量檢測(cè)將線(xiàn)粒體DNA作為整體進(jìn)行計(jì)數(shù)，隨機(jī)誤差小，具有較高的穩(wěn)定性。其次，本發(fā)明的 裝置對(duì)線(xiàn)粒體DNA的檢測(cè)方法為全基因組測(cè)序中的一個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，隨著研究的加深，可以 將其與癌癥的各種相關(guān)基因進(jìn)行更深入的相關(guān)分析，使檢測(cè)結(jié)果具有橫向可比性。再次，本 發(fā)明的檢測(cè)裝置中所使用的計(jì)算方法為精確的定量方法，只需計(jì)數(shù)，讀數(shù)即可，不存在模型 擬合導(dǎo)致不同模型結(jié)論不一致的情況，其檢測(cè)結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性。
[0010] 另一方面，作為一種癌癥的篩查檢測(cè)裝置，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的該種檢測(cè) 裝置在對(duì)癌癥的早期篩查方面還具備以下特點(diǎn)：（1)無(wú)創(chuàng)：通過(guò)抽血來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)受檢者 的身體沒(méi)有傷害，整個(gè)檢查過(guò)程幾乎沒(méi)有痛苦；（2)早期篩查：利用該裝置能比影像診斷早 幾個(gè)月發(fā)現(xiàn)腫瘤組織；（3)適用面廣：能夠發(fā)現(xiàn)幾乎所有的實(shí)體瘤；(4)準(zhǔn)確率和靈敏度高： 基于DNA序列水平進(jìn)行檢測(cè)，不易發(fā)生誤診；（5)實(shí)時(shí)監(jiān)控：游離DNA(cfDNA)在體內(nèi)的半衰 期為16分鐘至1小時(shí)，因此本裝置的檢測(cè)結(jié)果還能作為腫瘤術(shù)后或治療效果評(píng)估的實(shí)時(shí)指 標(biāo)；(6)由于不同癌癥的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異不一致，本發(fā)明的實(shí)施方式中所做的線(xiàn)粒體 DNA拷貝數(shù)還可能成為一種癌癥的分型指標(biāo)。
[0011] 具體地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置中， 待檢樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝指數(shù)為：待檢樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù) 的相對(duì)比值Mt或以Mt為單變量的單調(diào)函數(shù)值，且：Mt=nt (chrM)/len(chrM)/nt (chrN)/ len(chrN)，其中：nt(chrM)為待檢樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類(lèi)參考基因組的線(xiàn)粒體DNA上 的測(cè)序條數(shù)，len(chrM)為人類(lèi)參考基因組的線(xiàn)粒體DNA的長(zhǎng)度（DNA的長(zhǎng)度一般為取定的 染色體的bp(basepair)堿基數(shù)），nt (chrN)為待檢樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類(lèi)參考基因 組的核內(nèi)DNA上的測(cè)序條數(shù)，len(chrN)為人類(lèi)參考基因組的核內(nèi)DNA的長(zhǎng)度。核內(nèi)DNA的 選擇可以為多種，例如可選擇常染色體DNA、或者常染色體DNA+性染色體DNA;甚至是取一 組特定的panel，分別代表線(xiàn)粒體和細(xì)胞核內(nèi)的DNA的拷貝數(shù)。值得補(bǔ)充說(shuō)明的是，本發(fā)明 的實(shí)施方式所提出的上述指標(biāo)，即線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù)的相對(duì)比值，其單位 為1，理論上可以兼容用panel或者qPCR得到的對(duì)應(yīng)數(shù)值結(jié)果。
[0012] 此外，以Mt為單變量的單調(diào)函數(shù)值例如可以為Mt的自然對(duì)數(shù)值lnMt、Mtn(n>l)等， 取決于所采用的統(tǒng)計(jì)方法的不同。當(dāng)然，在上述對(duì)待檢樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝指數(shù)的計(jì)算 過(guò)程中，還可以有各種變換或替代方案，例如線(xiàn)粒體DNA可以選擇線(xiàn)粒體上的一個(gè)或幾個(gè) 區(qū)間作為計(jì)算指標(biāo)，核內(nèi)DNA也可以選擇某一個(gè)或幾個(gè)區(qū)間作為計(jì)算指標(biāo)，均可以實(shí)現(xiàn)本 發(fā)明的目的。
[0013] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置中， 比較判斷單元中的診斷界限值通過(guò)下述方法得出：
[0014] (1)取一組健康人群血漿中的游離DNA作為對(duì)照樣本群，以測(cè)序單元相同的裝置 對(duì)該對(duì)照樣本群進(jìn)行全基因組測(cè)序，計(jì)算每個(gè)對(duì)照樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝指數(shù)，對(duì)照樣本 的線(xiàn)粒體DNA拷貝指數(shù)為對(duì)照樣本的線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù)的相對(duì)比值Mh 或以 ％為單變量的單調(diào)函數(shù)值，且：MH=nH(chrM)/len(chrM)/nH(chrN)/len(chrN)，其 中：nH(chrM)為對(duì)照樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類(lèi)參考基因組的線(xiàn)粒體DNA上的測(cè)序條數(shù)， len(chrM)為人類(lèi)參考基因組的線(xiàn)粒體DNA的長(zhǎng)度，nH(chrN)為對(duì)照樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì) 到人類(lèi)參考基因組的核內(nèi)DNA上的測(cè)序條數(shù)，len(chrN)為人類(lèi)參考基因組的核內(nèi)DNA的 長(zhǎng)度。
[0015] (2)取一組癌癥患者血漿中的游離DNA作為癌癥樣本群，以測(cè)序單元相同的裝置 對(duì)癌癥樣本群進(jìn)行全基因組測(cè)序，