分別計(jì)算每個(gè)癌癥樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)，癌癥樣 本的線粒體DNA拷貝指數(shù)為癌癥樣本的線粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù)的相對(duì)比值 Mc或以Mc為單變量的單調(diào)函數(shù)值，且：Mc=nc(chrM)/len(chrM)/nc(chrN)/len(chrN)，其 中：ne(chrM)為癌癥樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類參考基因組的線粒體DNA上的測(cè)序條數(shù)， len(chrM)為人類參考基因組的線粒體DNA的長(zhǎng)度，ne(chrN)為癌癥樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì) 到人類參考基因組的核內(nèi)DNA上的測(cè)序條數(shù)，len(chrN)為人類參考基因組的核內(nèi)DNA的 長(zhǎng)度。
[0016] (3)對(duì)上述對(duì)照樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)和癌癥樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)分 別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、然后進(jìn)行顯著性檢測(cè)，繪制受試者工作特征曲線（R0C曲線），并從R0C曲線上 得到線粒體DNA拷貝指數(shù)的診斷界限值。具體來(lái)說(shuō)，顯著性檢測(cè)的方法例如可以為常規(guī)的 t.test。在R0C曲線上，最靠近左上角的R0C曲線的點(diǎn)是以此為閾值得到假陽(yáng)性和假陰性 的累積最少的點(diǎn)，可以選擇該閾值為診斷界限值，并以此值為中心構(gòu)建模糊區(qū)。
[0017] 此外，在進(jìn)行診斷界限值的確定過(guò)程中，以mh為單變量的單調(diào)函數(shù)值也可以有多 種選擇，例如可以為MH的自然對(duì)數(shù)值lnMH*MHn(n>l)等；以M。為單變量的單調(diào)函數(shù)值也可 以有多種選擇，例如可以為M。的自然對(duì)數(shù)值InM?；騇en(n>l)等。當(dāng)然，對(duì)MJPM。取單變量 的單調(diào)函數(shù)值的計(jì)算方法需要與裝置的計(jì)算單元中計(jì)算待檢樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù) 的方法相同，以此保證診斷界限值的適用性。
[0018] 優(yōu)選地，上述確定診斷界限值的方法中，步驟（3)中對(duì)所述對(duì)照樣本的線粒體 DNA拷貝指數(shù)和癌癥樣本的線粒體DNA拷貝指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)之后，可先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)的步 驟，確認(rèn)符合正態(tài)分布再后進(jìn)行顯著性檢測(cè)。做正態(tài)性檢驗(yàn)的方法可以使用R語(yǔ)言中的 shapiro.test。具體舉例來(lái)說(shuō)，如果％和M。的數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)后被證實(shí)符合正態(tài)性分布，則對(duì) M#PM。進(jìn)一步使用t.test進(jìn)行顯著性檢測(cè)，并繪制R0C曲線，從R0C曲線上得出針對(duì)線粒 體DNA拷貝數(shù)M的診斷界限值。但是，如果在對(duì)％和M。的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)的結(jié)果顯示 其不符合正態(tài)性分布，則進(jìn)一步對(duì)％和M。的函數(shù)值進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，例如可分別對(duì)MM。 取自然對(duì)數(shù)值，在驗(yàn)證lnM#PInM。符合正態(tài)性分布之后，對(duì)lnM#PInM。進(jìn)一步使用t.test進(jìn)行顯著性檢測(cè)，并繪制ROC曲線，從ROC曲線上得出針對(duì)線粒體DNA拷貝數(shù)InM的診斷界 限值。當(dāng)然，線粒體DNA拷貝值數(shù)除了可以為線粒體DNA拷貝數(shù)本身及其對(duì)數(shù)值之外，還可 有其他替代和變換；對(duì)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)性檢測(cè)和顯著性檢測(cè)所使用的方法也可以選擇其 他的統(tǒng)計(jì)方法替代。
[0019]本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置，測(cè)序單元中用 于對(duì)基因組DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序的模塊可以是高通量測(cè)序模塊、也可以是基因芯片模 塊。當(dāng)用于全基因組測(cè)序的模塊為高通量測(cè)序模塊時(shí)，該高通量測(cè)序模塊可進(jìn)一步包括建 庫(kù)試劑盒和高通量測(cè)序試劑盒；該高通量測(cè)序模塊對(duì)待檢血漿樣本中的游離DNA進(jìn)行全基 因組高通量測(cè)序。本裝置中的高通量測(cè)序模塊可選擇適于各種高通量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)的建庫(kù) 試劑盒和高通量測(cè)序試劑盒，例如Illumina、454、LifeTechnolnies和PacBio等主流或其 它高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0020] 此外，也可以用基因芯片測(cè)序來(lái)代替高通量測(cè)序，以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的檢測(cè)目的。當(dāng)測(cè) 序單元包括基因芯片模塊時(shí)，該基因芯片模塊進(jìn)一步包括基因芯片和雜交信號(hào)檢測(cè)器；該 基因芯片模塊對(duì)待檢血漿樣本中的游離DNA進(jìn)行雜交測(cè)序，并檢測(cè)每個(gè)基因組窗口的雜交 信號(hào)強(qiáng)弱值，根據(jù)雜交信號(hào)強(qiáng)弱值定量出比對(duì)到線粒體DNA、核內(nèi)DNA上的測(cè)序條數(shù)。其中， 上述的雜交信號(hào)可以為熒光信號(hào)，則雜交信號(hào)檢測(cè)器為熒光信號(hào)檢測(cè)器。高通量測(cè)序技術(shù) 或基因芯片技術(shù)都可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，相比之下，基因芯片模塊的成本更低，但高通量測(cè) 序模塊的檢測(cè)準(zhǔn)確率較高。
[0021] 優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置的測(cè)序 單元中，還包括質(zhì)檢模塊和/或數(shù)據(jù)優(yōu)化模塊，質(zhì)檢模塊用于在對(duì)待檢者血漿中的游離DNA 進(jìn)行全基因組測(cè)序之前，進(jìn)行DNA濃度和片段大小的質(zhì)檢。而數(shù)據(jù)優(yōu)化模塊，用于對(duì)全基 因組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化處理，例如將經(jīng)過(guò)質(zhì)檢流程的測(cè)序條數(shù)與人類參考基因組進(jìn)行比對(duì) 時(shí)，設(shè)定單位序列允許錯(cuò)配個(gè)數(shù)、是否只留unique序列等。上述增設(shè)質(zhì)檢模塊和/或數(shù)據(jù) 優(yōu)化模塊的目的，均是希望提高測(cè)序數(shù)據(jù)用于后續(xù)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析過(guò)程中的準(zhǔn)確性和可 靠性。
[0022] 此外，本發(fā)明的實(shí)施方式所提供的線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置，還可以 進(jìn)一步包含樣本制備單元，其用于從待檢者靜脈抽取外周血，并分離得到血漿中的游離 DNA。上述的樣本制備單元可包含靜脈采血針、真空采血管、血液抗凝劑EDTA、血細(xì)胞保護(hù)劑 和血漿游離DNA純化試劑盒。樣本制備單元的增設(shè)，可使本發(fā)明的線粒體DNA拷貝數(shù)不穩(wěn) 定性的檢測(cè)裝置在結(jié)構(gòu)組成和功能上更為完整全面。
[0023] 綜上所述，本發(fā)明的實(shí)施方式提供了一種線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置， 并首次提出了一個(gè)用來(lái)篩查癌癥的理想指標(biāo)：線粒體DNA拷貝數(shù)變異性。本裝置基于分子 生物學(xué)測(cè)序技術(shù)和后續(xù)的生物信息學(xué)分析，通過(guò)檢測(cè)血漿中線粒體DNA拷貝數(shù)變異，用來(lái) 判別待檢者罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。只要是符合本篩查裝置的檢測(cè)流程（通過(guò)抽血、檢測(cè)血液中 的游離DNA，以線粒體DNA拷貝數(shù)與核內(nèi)DNA拷貝數(shù)的相對(duì)比值為指標(biāo)，來(lái)識(shí)別是否有癌癥 發(fā)生），無(wú)論是否采用高通量測(cè)序技術(shù)或基因芯片技術(shù)、是否采用本專利描述的生物信息學(xué) 分析方法中用到的參數(shù)，都應(yīng)該受到本專利的保護(hù)。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1是實(shí)施例2中對(duì)InM值做顯著性檢測(cè)所繪制的R0C曲線圖；
[0025] 圖2是實(shí)施例2中對(duì)InM值的分組箱圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的各實(shí) 施方式進(jìn)行詳細(xì)的闡述。然而，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，在本發(fā)明各實(shí)施方式中， 為了使讀者更好地理解本申請(qǐng)而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒(méi)有這些技術(shù)細(xì)節(jié)和基 于以下各實(shí)施方式的種種變化和修改，也可以實(shí)現(xiàn)本申請(qǐng)各權(quán)利要求所要求保護(hù)的技術(shù)方 案。
[0027] 實(shí)施例1 一種線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置
[0028] 本實(shí)施例涉及一種線粒體DNA拷貝數(shù)變異性的檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)組成，該裝置包括 樣本制備單元、測(cè)序單元、計(jì)算單元和比較判斷單元，其中：
[0029] 樣本制備單元包括一次性靜脈采血針、一次性真空采血管、血液抗凝劑EDTA、血細(xì) 胞保護(hù)劑、血漿游離DNA純化試劑盒，該樣本制備單元用于從待檢者靜脈抽取外周血，并分 離得到其血漿中的游離DNA。
[0030] 測(cè)序單元包括質(zhì)檢模塊、高通量測(cè)序模塊以及數(shù)據(jù)優(yōu)化模塊，且高通量測(cè)序模塊 進(jìn)一步包括建庫(kù)試劑盒和高通量測(cè)序試劑盒。質(zhì)檢模塊用于在對(duì)樣本制備單元所提供的待 檢者血漿中的游離DNA進(jìn)行全基因組測(cè)序之前，進(jìn)行DNA濃度和片段大小的質(zhì)檢；高通量測(cè) 序模塊用于對(duì)待檢者血漿中的游離DNA進(jìn)行全基因組高通量測(cè)序，得到高通量測(cè)序結(jié)果序 列；數(shù)據(jù)優(yōu)化模塊用于對(duì)高通量測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。
[0031] 計(jì)算單元，其將待檢樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類參考基因組上，并根據(jù)下式計(jì)算 待檢樣本的線粒體DNA拷貝數(shù)和核內(nèi)DNA拷貝數(shù)的相對(duì)比值Mt:
[0032] Mt= nt (chrM)/1en(chrM)/nt (chrN)/1en(chrN),
[0033] 其中：nt (chrM)為待檢樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類參考基因組的線粒體DNA上的 測(cè)序條數(shù)；len(chrM)為人類參考基因組的線粒體DNA的長(zhǎng)度，len(chrM)在本實(shí)施方式中 取值16569bp;nt (chrN)為待檢樣本的測(cè)序結(jié)果比對(duì)到人類參考基因組的常染色體上的測(cè) 序條數(shù)；len(chrN)為人類參考基因組的常染色體的長(zhǎng)度，len(chrN)在本實(shí)施方式中取值 2756335119bp。本實(shí)施例中的計(jì)算單元還進(jìn)一步根據(jù)待檢樣本的線粒體DNA拷貝數(shù)隊(duì)計(jì) 算其自然對(duì)數(shù)值lnMt。
[0034] 比較判斷單元，其將上述計(jì)算單元計(jì)算得到的待檢樣本的線粒體DNA拷貝數(shù)隊(duì)或 其自然對(duì)數(shù)值lnMt與預(yù)先設(shè)定的診斷界限值進(jìn)行比較，判斷待檢樣本是否存在線粒體DNA 拷貝數(shù)變異