一種多肽、其應(yīng)用及包含該多肽的藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種多肽、其應(yīng)用及包含該多肽的藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 牙周病被認(rèn)為是由牙菌斑導(dǎo)致的牙周組織破壞的疾病。大量的研究表明牙齦卟啉 單胞菌（Porphyromonasgingivalis，P.g)是人類牙周疾病重要的致病菌，該菌是革蘭陰性 菌、產(chǎn)黑色素、不酵解糖、分解蛋白的專性厭氧類桿菌，是慢性牙周炎病變區(qū)或活動進(jìn)展區(qū) 最主要的優(yōu)勢菌，其致病因子主要有脂多糖、蛋白酶、血凝素、菌毛及膜泡。牙齦卟啉單胞菌 的新陳代謝和毒力需要卟啉和鐵，但是其本身缺乏合成卟啉和鐵的能力，必須從外界攝取， 研究也證實(shí)了牙齦卟啉單胞菌通過從外界獲取血紅素為自身提供卟啉和鐵，在炎癥性牙周 袋病變區(qū)，血紅蛋白成為了血紅素卟啉和鐵的來源。
[0003] 美國和澳大利亞學(xué)者發(fā)現(xiàn)血凝素2 (hemagglutinin-2,HA-2)在牙銀卟啉單胞菌 與血紅蛋白、血紅素的結(jié)合中發(fā)揮重要的作用。HA-2又稱為血紅蛋白受體（hemoglobin receptor，HbR)、高相對分子質(zhì)量牙銀素（highmolecularmassgingipain，Hgp_15)。HA-2 基因是牙齦卟啉單胞菌的胰酶樣蛋白酶基因血凝素結(jié)構(gòu)域HA-l、HA-2、HA-3和HA-4四部分 的第2部分。
[0004] 許多研究都發(fā)現(xiàn)，HA-2不僅能結(jié)合血紅蛋白的血卟啉，還能直接與血紅素結(jié)合，并 只和卟啉環(huán)結(jié)合，而不像某些蛋白直接結(jié)合鐵離子。例如，張荃等研究發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者 齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌HA-2的DNA和RNA水平的檢出率達(dá)85%，HA-2DNA水平的基因 量與牙周探針深度及牙齦指數(shù)具有正相關(guān)關(guān)系，揭示了HA-2基因廣泛存在于慢性牙周炎 患者的齦下菌斑中，且可能參與了牙齦卟啉單胞菌的致病。牙齦卟啉單胞菌自發(fā)的非黑色 變異株，kgp基因中包含編碼HA-2區(qū)域的變異株，其與血紅蛋白和氯化高鐵血紅素的結(jié)合 能力下降了 50%。撤_2特異性抗體免疫球蛋白G(immunoglobulinG，IgG)能50%阻斷HA-2 與血紅蛋白或血紅素的結(jié)合，證實(shí)了HA-2蛋白是牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞表面結(jié)合血紅蛋白 或亞鐵血紅素的主要參與者。研究還發(fā)現(xiàn)HA-2抗血清抑制了牙齦卟啉單胞菌與血紅蛋白 的結(jié)合，也說明了HA-2參與了牙齦卟啉單胞菌與血紅蛋白的結(jié)合。有研究學(xué)者通過對牙齦 卟啉單胞菌的細(xì)胞表面提取物進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了HA-2與血紅素具有高親和力，主要參與與 血紅素的結(jié)合，從而提供細(xì)菌生長和毒力所需要的卟啉和鐵元素部分。而Paramaesvaran 等證實(shí)了牙齦卟啉單胞菌細(xì)胞表面的HA-2以高親和力與血紅蛋白的血卟啉結(jié)合。這些都 表明HA-2參與了牙齦卟啉單胞菌與血紅蛋白、血紅素的結(jié)合。
[0005]Nguyen等用ELISA法檢測人血清抗rHA-l、HA-2、HA-3和HA-4的抗體水平發(fā)現(xiàn)，血 清抗HA-2抗體水平遠(yuǎn)低于HA-4、HA-3及HA-1。血清抗HA-1、HA-3和HA-4抗體滴度與慢 性牙周炎嚴(yán)重程度無關(guān)，提示抗HA-1、HA-3和HA-4的抗體可能不具有保護(hù)性?？笻A-2的 血清抗體滴度很低不易測出，且經(jīng)治療后，一些慢性牙周炎患者血清HA-2抗體水平升高， 提示了患者抗HA-2抗體的缺乏可能是牙周病發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素。DeCarlo等對人 血清抗重組HA-2特異抗體水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)血清中抗HA-2抗體IgG的滴度與牙周健康 及附著喪失之間存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測可能是因為該抗體具有中和牙齦卟啉單胞菌捕獲血 紅蛋白的能力。治療后血清抗HA-2抗體IgG的滴度直接與牙齦卟啉單胞菌蛋白酶kgp結(jié) 合血紅蛋白的中和能力相關(guān)，治療后血清IgG對牙銀卟琳單胞囷蛋白酶kgp結(jié)合血紅蛋白 的中和能力低下與重度牙周炎的發(fā)生有直接關(guān)系，以上結(jié)果揭示了HA-2抗體對牙周病的 免疫保護(hù)作用。DeCarlo等用rHA-2免疫大鼠預(yù)防了牙齦卟啉單胞菌感染所引起的牙槽骨 吸收，說明了rHA-2作為牙周病疫苗抗原的潛在應(yīng)用價值。
[0006]目前，研究已證實(shí)了牙齦卟啉單胞菌在慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫、牙 髓感染等口腔疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。同時，研究還表明，牙齦卟啉單胞菌 存在于全身組織中，可引起全身性疾病，例如心腦血管疾病和肺部感染等全身系統(tǒng)性疾病， 抑制牙齦卟啉單胞菌藥物的開發(fā)將有助于預(yù)防及治療由牙齦卟啉單胞菌引起的全身性疾 病。因為牙齦卟啉單胞菌HA-2直接參與了牙齦卟啉單胞菌與血紅蛋白、血紅素的結(jié)合，所 以針對HA-2的抑制劑在制備抑制牙齦卟啉單胞菌的藥物上具有一定的優(yōu)勢，但是目前還 沒有相關(guān)的抑制劑，所以急需一種能夠特異性抑制HA-2活性的抑制劑，來抑制HA-2與血紅 蛋白、血紅素的結(jié)合，進(jìn)而阻斷牙齦卟啉單胞菌攝取卟啉和鐵，最終達(dá)到防治相關(guān)疾病的目 的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供一種多肽、其應(yīng)用以及包含該多肽的藥物。 該多肽能夠抑制重組HA-2蛋白與氯化血紅素的結(jié)合，抑制牙齦卟啉單胞菌的生長，可以應(yīng) 用于制備防治由牙齦卟啉單胞菌引起的疾病的藥物。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0009] 本發(fā)明提供了一種多肽，其具有如（I)、（II)所示的氨基酸序列中任意一個：
[0010] ⑴具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列；
[0011](II)具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個或多個氨基 酸獲得的氨基酸序列。
[0012] 研究發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌HA-2具有與血紅蛋白、血紅素或氯化血紅素結(jié)合的功 能，但是HA-2與氯化血紅素結(jié)合的位點(diǎn)是未知的。本發(fā)明通過多肽內(nèi)切酶消化重組HA-2 蛋白，獲得多肽片段之后，進(jìn)行多肽的氨基酸序列分析，并結(jié)合HA-2突變重組蛋白的氯化 血紅素結(jié)合功能測定，最終確定了HA-2的1001位組氨酸參與了重組HA-2與氯化血紅素的 結(jié)合。具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列為HA-2氨基酸序列中第1000位至第1008 位所對應(yīng)的氨基酸序列，該序列包含HA-2的第1001位組氨酸，氯化血紅素結(jié)合抑制實(shí)驗證 實(shí)了具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列的多肽能夠有效抑制重組HA-2蛋白與氯化血 紅素的結(jié)合，體外抑菌實(shí)驗證實(shí)了該多肽能夠抑制牙齦卟啉單胞菌的生長，能夠應(yīng)用于制 備防治由牙齦卟啉單胞菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)取代一個或 多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，取代氨基酸的個數(shù)為1個、2個、3個、4個或5個。
[0014] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)取代一個或 多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，被取代的氨基酸為天門冬氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨 酸或賴氨酸。
[0015] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列經(jīng)添加一個或 多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，添加氨基酸的個數(shù)不少于1個。
[0016] 更為優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)添加一 個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，添加氨基酸的個數(shù)具體為1個、2個、3個、4個、5個、 6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個13個或14個。
[0017] 更為優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)添加一 個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，添加氨基酸的個數(shù)具體為1個、2個、3個、4個、5個、 6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個。
[0018] 更為優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)添加一 個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，當(dāng)添加氨基酸的個數(shù)具體為6個時，本發(fā)明提供的 多肽的氨基酸序列不為具有如SEQIDN0 :10所示的氨基酸序列。
[0019] 更為優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)添加一 個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，當(dāng)添加氨基酸的個數(shù)為9個時，本發(fā)明提供的多肽 的氨基酸序列不為具有如SEQIDN0 :11所示的氨基酸序列。
[0020] 更為優(yōu)選地，本發(fā)明提供的多肽具有如SEQIDN0 :1所示的氨基酸序列經(jīng)添加一 個或多個氨基酸獲得的氨基酸序列時，當(dāng)添加氨基酸的個數(shù)為5個時，本發(fā)明