一種新型篩選標(biāo)記玉米絲氨酸消旋酶基因應(yīng)用于煙草轉(zhuǎn)化技術(shù)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及組織培養(yǎng)技術(shù)和植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種玉米絲氨酸消旋酶基 因作為篩選標(biāo)記在煙草遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物的遺傳轉(zhuǎn)化研宄主要是通過將具有優(yōu)良性狀的外源目的基因?qū)氲街参锘?因組中，用標(biāo)記基因篩選出真正含有目的基因片段的轉(zhuǎn)化體，并使其完整再生，通過這種方 式獲得遺傳性狀改良的轉(zhuǎn)化植株。其中標(biāo)記基因可以在遺傳轉(zhuǎn)化中篩選和鑒定出轉(zhuǎn)化的植 物細(xì)胞、植物組織和轉(zhuǎn)基因植株，起到區(qū)分轉(zhuǎn)化和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的關(guān)鍵作用。依據(jù)篩選方法不 同可分為選擇標(biāo)記（selectivegene)和報(bào)告基因（reportergene)。選擇標(biāo)記基因通常是 指抗生素和除草劑抗性基因，而報(bào)告基因有葡萄糖苷酸酶基因（GUS)、熒光素酶基因（LUC) 和綠色熒光蛋白基因（GFP)等。出于對(duì)生態(tài)環(huán)境以及轉(zhuǎn)基因食品的生物安全性等方面的考 慮，標(biāo)記基因又可分為傳統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因（traditionalselectivemarkergene)和生 物安全性標(biāo)記基因（biosafetymarkergene)。
[0003] 目前傳統(tǒng)的選擇標(biāo)記基因分為抗生素類標(biāo)記基因以及抗除草劑類標(biāo)記基因。其 作用原理是通過在選擇壓力下篩選出來轉(zhuǎn)化體。前者可以使抗生素失去活性，從而解除抗 生素對(duì)轉(zhuǎn)化細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程中的抑制作用，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以繼續(xù)生長(zhǎng)。其中卡那霉 素抗性（Kanamycin，Kan)基因是轉(zhuǎn)基因植物中被廣泛使用的一類標(biāo)記基因，但由于卡那 霉素選擇劑對(duì)一些植物的生長(zhǎng)發(fā)育存在著嚴(yán)重的副作用，且選擇效率低下。而抗除草劑類 標(biāo)記基因能通過抵抗除草劑的殺滅作用，使得轉(zhuǎn)化子從野生背景中富集出來，例如草丁膦 乙酰轉(zhuǎn)移酶（phosphinothricinacetyltransferase，PAT)基因、2,4_D單氧化酶（2,4_D monooxygenase，tfdA)基因和5_稀醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS)基因等。但有些報(bào)道表示，釋放轉(zhuǎn)入抗除草劑 類標(biāo)記基因的植物，很有可能會(huì)導(dǎo)致環(huán)境中除草劑施用量達(dá)到選擇濃度，從而發(fā)生一系列 生物安全性問題，諸如基因漂流、生態(tài)平衡破壞和自然生物種群發(fā)生改變等。因此，這兩類 標(biāo)記基因?qū)τ诃h(huán)境均存在著潛在的生物安全性問題。
[0004] 絲氨酸消旋酶（SerineRacemase，SR)被發(fā)現(xiàn)存在于多種生物體中，是一種雙 功能酶，同時(shí)具有消旋酶和脫水酶兩種活性?；诮z氨酸消旋酶的起源和功能，可以將 絲氨酸消旋酶分為兩類，第一類是細(xì)菌中的絲氨酸消旋酶，如鶴雞腸球菌（Enterococcus Gallinarum，EG)和鏈霉菌屬（StreptomycesGaryphalus，SG)。第二類是真核生物中的絲 氨酸消旋酶，如水稻、人類、小鼠、裂殖酵母、細(xì)胞粘菌等。這些真核生物中的絲氨酸消旋酶 屬于II型5'-磷酸吡卩多酸酶（5'_pyridoxalphosphateenzyme，PLP)系，對(duì)PLP酶具有高 度的特異性。
[0005]由于體外添加的D-絲氨酸對(duì)植物有毒害作用，植物體內(nèi)能夠去除D-絲氨酸毒性 的酶如D-絲氨酸消旋酶，對(duì)植物具有解毒的功能，因此D-絲氨酸消旋酶可以作為植物核基 因組轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記。玉米絲氨酸消旋酶（maizeserineracemase，SR)是一類依賴PLP型 酶，同時(shí)具有消旋酶和脫水酶的兩種活性。目前發(fā)現(xiàn)D-絲氨酸消旋酶能夠介導(dǎo)植物開花。 因此它更適合作為楊樹的轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記。可以將ZmSR作為一種新型的無抗性篩選標(biāo)記 基因，D-絲氨酸作為篩選試劑來篩選轉(zhuǎn)基因植株，具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值，為ZmSR作為 篩選標(biāo)記的可行性提供依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種玉米絲氨酸消旋酶基因及其表達(dá)載體，以及該基因作為 篩選標(biāo)記應(yīng)用于煙草遺傳轉(zhuǎn)化。
[0007] 本發(fā)明所涉及的設(shè)計(jì)方案為一種玉米絲氨酸消旋酶基因，ZmSR通過B73自交系三 葉期cDNA為模板克隆獲得，經(jīng)過測(cè)序其為1014bp，與NCBI網(wǎng)站公布的玉米絲氨酸消旋酶基 因（NM_001143〇28. 1)序列一致。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種玉米絲氨酸消旋酶基因表達(dá)的載體，其特征在于能作為篩選 標(biāo)記在煙草遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。利用前述的玉米絲氨酸消旋酶基因?qū)⑻鎿Q雙元表達(dá)載體 PCAMBIA1301上的⑶S標(biāo)記基因，將該載體命名為pBI1301-ZmSR。本研宄利用玉米絲氨酸 消旋酶基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將pBI1301-ZmSR和含有⑶S基因的pBI121載體分別轉(zhuǎn)入 煙草葉片及愈傷組織。通過對(duì)煙草培養(yǎng)基條件的篩選，優(yōu)化了煙草葉片最佳誘導(dǎo)愈傷的培 養(yǎng)基為：MS+6-BA0. 5mg/L+NAA2.0mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂6g/L。該培養(yǎng)基的誘導(dǎo)愈傷的 誘導(dǎo)率為100%，并且速度最快，愈傷增殖的效果最好。以ZmSR為目的基因，以GUS作為對(duì) 照基因，分別用D-絲氨酸和Kan作為篩選試劑，對(duì)未轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行Kan和D-絲氨酸抗性臨 界濃度的篩選。對(duì)煙草葉片進(jìn)行Kan及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗(yàn)，分別確定臨界濃度為 50mg/L和12mM。對(duì)煙草愈傷組織進(jìn)行Kan及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗(yàn)，分別確定煙草 愈傷組織的臨界濃度為30mg/L和6mM。經(jīng)分子檢測(cè)由葉片篩選獲得的pBI1301-ZmSR抗性 苗有3株為陽性植株，由愈傷組織獲得的抗性苗有6株為陽性植株。
[0009] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種玉米絲氨酸消旋酶基因。
[0010] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了所述基因作為篩選標(biāo)記在煙草遺傳轉(zhuǎn)化中的 應(yīng)用。
[0011] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含所述玉米絲氨酸消旋酶基因的植物表達(dá)載 體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是用所述玉米絲氨酸消旋酶基因取代植物雙元表達(dá)載體 PCAMBIA1301上的⑶S基因，從而構(gòu)建得到的植物表達(dá)載體。在另一實(shí)施方案中，所述植物 表達(dá)載體能作為一種篩選標(biāo)記基因在煙草遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用。
[0012] 有益效果：本發(fā)明提供的一個(gè)玉米絲氨酸消旋酶能作為一種篩選標(biāo)記基因在煙草 遺傳轉(zhuǎn)化應(yīng)用，第一次應(yīng)用于煙草的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，較卡那霉素作為篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)化體 系，不僅能篩選得到陽性抗性苗，具有低污染率、高分化率，由于該基因有降解植株體內(nèi)的 D-絲氨酸毒素功能，對(duì)植物生長(zhǎng)和環(huán)境又具有安全無危害。因此，該基因作為一種無抗性篩 選標(biāo)記基因篩選轉(zhuǎn)基因植株，具有潛在的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0013] 圖1煙草葉片分化對(duì)Kan及D-絲氨酸敏感性試驗(yàn)
[0014]A，卡那霉素葉片分化抗性篩選結(jié)果；B，D-絲氨酸葉片分化抗性篩選結(jié)果
[0015] 圖2含有⑶S基因的pBI121和pBI1301-ZmSR載體分別轉(zhuǎn)化煙草葉片及愈傷組織 的對(duì)比性試驗(yàn)
[0016]A，轉(zhuǎn)化煙草葉片對(duì)比性試驗(yàn)的結(jié)果；B，轉(zhuǎn)化煙草愈傷組織對(duì)比性試驗(yàn)結(jié)果
[0017] 圖3轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果
[0018] A基因組特異引物擴(kuò)增電泳圖譜（葉片篩選）
[0019] M，DL2000 ;1，為未轉(zhuǎn)化植株葉片基因組（陰性對(duì)照）；2,為重組質(zhì)粒（陽性對(duì)照）； 3-7,為D-絲氨酸抗性植株葉片基因組；
[0020] B葉片基因組特異引物擴(kuò)增電泳圖譜（愈傷篩選）
[0021]M，DL2000;1:為重組質(zhì)粒（陽性對(duì)照）；2,為未轉(zhuǎn)化植株葉片基因組（陰性對(duì)照）； 3-10:為D-絲氨酸抗性植株葉片基因組
[0022] 圖4轉(zhuǎn)基因煙草的表型形狀的觀察
[0023]A，轉(zhuǎn)基因煙草一個(gè)月表型；B，轉(zhuǎn)基因煙草三個(gè)月表型
[0024]ZmSR，pBI1301-ZmSR載體煙草；CK，未轉(zhuǎn)基因植株；⑶S，轉(zhuǎn)含有⑶S基因的pBI121 載體煙草
[0025] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 所用引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成，上海生工公司測(cè)序；Taq酶、 Trans5a感受態(tài)及相關(guān)的試劑盒購(gòu)置北京全式金公司；限制性內(nèi)切酶NcoI和BstpI，T4 連接酶購(gòu)自TaKaRa公司；相應(yīng)的抗生素來自上海生工和SIGMA公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分 析純。本研宄所用的含有GUS基因的pBI121載體以及根癌農(nóng)桿菌LBA4404由本實(shí)驗(yàn)室保 存，雙元表達(dá)載體PCAMBIA1301由生命科學(xué)學(xué)院作物生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。下述實(shí)施例中 所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。
[0027] 實(shí)施例1.載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化
[0028] 以玉米B73自交系三葉期