cDNA為模板克隆獲得，根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布序列 (NM_001143028. 1)設(shè)計引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位點，下游加BstpI(GGTAACC)酶 切位點，引物如下：
[0029]引物1(上游引物）：5' -CATGCCATGGATGGGAAGTAAAGACGGCACCGG-3'
[0030]引物 2 (下游引物）：5 ' -GGGTAACCTCAGTGTTTGTACATAGACTG-3 '
[0031]PCR得到約lOOObp條帶，回收后得回收產(chǎn)物A，將回收產(chǎn)物用NcoI和BstPI雙 酶切獲得酶切之后的序列A。將pCAMBIA1301載體用NcoI和BstPI雙酶切，回收線性化 的PCAMBIA1301載體。用1\連接酶連接得酶切之后的序列A和線性化的pCAMBIA1301載 體獲得重組載體，重組載體命名為pBI1301-ZmSR，重組載體轉(zhuǎn)入Trans5a感受態(tài)中獲得轉(zhuǎn) 化菌株，將菌液送生工測序，得到結(jié)果與報道的序列一致，轉(zhuǎn)入的基因為玉米絲氨酸消旋酶 基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示。
[0032] 酶切體系如下：
[0033]
【主權(quán)項】
1. 一種用于煙草遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的基因，其特征為所述基因為玉米絲氨酸消旋酶基 因ZmSR，序列為如序列表中SEQIDNO: 1所示。
2. 權(quán)利要求1所述的玉米絲氨酸消旋酶基因ZmSR作為煙草遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記基因 的應(yīng)用。
3. 包含如權(quán)利要求1所述的玉米絲氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表達(dá)載體。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種玉米絲氨酸消旋酶基因ZmSR的植物表達(dá)載體，其特征 為用權(quán)利要求1所述的玉米絲氨酸消旋酶基因ZmSR替換雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301上的 ⑶S標(biāo)記基因。
5. -種制備權(quán)利要求4所述的植物表達(dá)載體的方法，其特征為步驟如下： (1) 以玉米B73自交系三葉期cDNA為模板克隆獲得，根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布序列 (NM_001143028. 1)設(shè)計引物，上游加NcoI(CCATGG)酶切位點，下游加BstpI(GGTAACC)酶 切位點，引物如下：
(2)PCR得到約1000 bp條帶，回收后得回收產(chǎn)物A，將回收產(chǎn)物用NcoI和BstPI雙酶 切獲得酶切之后的序列A;將pCAMBIA1301載體用NcoI和BstPI雙酶切，回收線性化的 PCAMBIA1301載體；用1\連接酶連接得酶切之后的序列A和線性化的pCAMBIA1301載體獲 得重組載體，重組載體命名為pBI1301-ZmSR，即包含如權(quán)利要求1所述的玉米絲氨酸消旋 酶基因ZmSR的植物表達(dá)載體pBI1301-ZmSR，pBI1301-ZmSR載體轉(zhuǎn)入Trans5a感受態(tài)中獲 得轉(zhuǎn)化菌株，將菌液送生工測序，得到結(jié)果與報道的序列一致，轉(zhuǎn)入的基因為玉米絲氨酸消 旋酶基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO: 1所示。 酶切體系如下：
6. -種含植物表達(dá)載體pBI1301-ZmSR的農(nóng)桿菌的制備方法，其特征為步驟如下：將驗 證正確的pBI1301-ZmSR載體通過液氮凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404中，用無菌牙簽挑取 ￥￡卩平板上的單菌落，接種于適量的含1^11(100 1^/1^)、把€(100 1^/1^)的液體￥￡?培養(yǎng)基 中，振蕩培養(yǎng)過夜培養(yǎng)；對農(nóng)桿菌LBA4404的質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定確認(rèn)，獲得含pBI1301-ZmSR 載體的農(nóng)桿菌LBA4404。
7. 權(quán)利要求3或4所述的植物表達(dá)載體作為表達(dá)煙草遺傳轉(zhuǎn)化的篩選標(biāo)記基因的應(yīng) 用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的植物表達(dá)載體，其特征在于能以根癌農(nóng)桿菌LBA4404作 為宿主，導(dǎo)入到煙草葉片和愈傷組織中。
9. 一種向煙草組織轉(zhuǎn)入如權(quán)利要求1所述玉米絲氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特征 為步驟如下： (1) 以玉米自交系B73三葉期的cDNA為模板克隆得到的ZmSR基因序列，引入NcoI 和BstpI為上下游酶切位點，替換雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301上的⑶S標(biāo)記基因獲得載體 pBI1301-ZmSR，將載體pBI1301-ZmSR導(dǎo)入到根癌農(nóng)桿菌LBA4404中； (2) 通過對煙草培養(yǎng)基條件的篩選，優(yōu)化煙草葉片最佳誘導(dǎo)愈傷的培養(yǎng)基； (3) 對煙草葉片進(jìn)行卡那霉素及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗，分別確定臨界濃度；對 煙草愈傷組織進(jìn)行卡那霉素及D-絲氨酸的抗性敏感性試驗，分別確定煙草愈傷組織的臨 界濃度； (4) 用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將載體pBI1301-ZmSR分別轉(zhuǎn)入到煙草葉片和愈傷組織中，并用卡 那霉素及D-絲氨酸篩選，最分子檢測由葉片和愈傷組織獲得的抗性苗獲得含玉米絲氨酸 消旋酶基因ZmSR的植株。
10. -種向煙草組織轉(zhuǎn)入如權(quán)利要求1所述玉米絲氨酸消旋酶基因ZmSR的方法，其特 征為步驟如下： (1) 受體材料的預(yù)培養(yǎng) 將皖煙1號煙草葉片切成〇.5cmXO. 5cm的小塊，接種在葉片不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA2.Omg/L+NAA0? 5mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂6g/L上進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)7d，用于葉片轉(zhuǎn)化材 料； (2) 愈傷組織誘導(dǎo)效果的對比性試驗 將皖煙1號煙草葉片切成〇. 5cmX0. 5cm的小塊，正面向上放置于培養(yǎng)基表面；培養(yǎng)基 以MS為基本培養(yǎng)基，pH為5. 8-6. 2 ;附加蔗糖25g/L、瓊脂6g/L;采用激素6-BA、2,4-D、NAA 和KT處理，每個處理接種90片； (3) 工程菌制備 從-70°C冰箱取出實施例1制備的含質(zhì)粒pBI1301-ZmSR的農(nóng)桿菌，蘸取少量菌體，接 種于含Kan50mg/L，Rif50mg/L的YEP平板上，于28°C遮光培養(yǎng)24h后，從活化平板上挑 取單菌落接種于有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C，220rpm培養(yǎng)約24h，視菌液濃度用不 含抗生素的YEP液體培養(yǎng)基按1:50的比例進(jìn)行稀釋，28°C220rpm振蕩培養(yǎng)4-6h，至相應(yīng) 〇D_值時，4°C，5000rpm離心5min收集菌體，用相同體積的MS液體培養(yǎng)基（含AS，濃度為 200iimol/L)懸浮備用； (4) 侵染與共培養(yǎng) 用含200ymol/LAS的MS液體培養(yǎng)基懸浮活化后的工程菌液，將預(yù)培養(yǎng)過的葉片及愈 傷組織分別浸入菌液中搖晃30min后，將葉片及愈傷組織用無菌濾紙吸干接種到共培養(yǎng)培 養(yǎng)基MS+6-BA2.Omg/L+NAA0? 5mg/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 6g/L+AS200ymol/L上，22°C遮光 培養(yǎng)3d; (5) 菌的清洗 待培養(yǎng)基中長出可見菌落即可進(jìn)行清洗，用無菌水洗葉片5-7次，再用含Cef400mg/L水浸泡，放入恒溫?fù)u床中振蕩半個小時，用無菌濾紙吸干，分別接種到恢復(fù)培養(yǎng)基MS+6-BA 2.Omg/L+NAA0? 5mg/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 6g/L+Cef400mg/L上，25°C左右遮光進(jìn)行恢復(fù)培 養(yǎng)7d; (6) 抗性苗的篩選 將恢復(fù)培養(yǎng)7d后的煙草葉片材料轉(zhuǎn)入含Kan50mg/L、頭孢霉素400mg/L和D-絲氨酸 12mM的分化培養(yǎng)基中；將愈傷組織材料轉(zhuǎn)入含Kan30mg/L、Cef400mg/L和D-絲氨酸6mM、 Cef400mg/L的分化培養(yǎng)基中；25°C遮光培養(yǎng)6d后，轉(zhuǎn)入光照時間為16h/d，光照強(qiáng)度為 2000-3000Lux條件下培養(yǎng)，每20d左右繼代一次最終獲得不定芽苗； (7) 生根選擇培養(yǎng) 待不定芽長到3cm以上時，切下并分別插入生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 2mg/L+Kan 30mg/ L+鹿糖20g/L+瓊脂6g/L和1/2MS+IBA 2mg/L+D-絲氨酸6mM+鹿糖20g/L+瓊脂6g/L上進(jìn) 行篩選培養(yǎng)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型篩選標(biāo)記玉米絲氨酸消旋酶基因應(yīng)用于煙草轉(zhuǎn)化技術(shù)。本發(fā)明以玉米自交系B73三葉期的cDNA為模板克隆得到玉米絲氨酸消旋酶基因序列(ZmSR)，將該基因替換雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301上的GUS標(biāo)記基因，將該載體命名為pBI1301-ZmSR。本研究利用玉米絲氨酸消旋酶基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對煙草葉片及愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，同時用含有GUS基因的pBI121載體導(dǎo)入煙草中作為對照，對比ZmSR和GUS基因在葉片及愈傷組織的轉(zhuǎn)化效果，為ZmSR作為新型無抗性篩選標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。
【IPC分類】A01H5-00, C12N15-55, C12N15-66, C12N15-84
【公開號】CN104711276
【申請?zhí)枴緾N201510121857
【發(fā)明人】范軍, 項艷, 趙華琳, 王蕾蕾, 董慶, 李媛
【申請人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年3月19日